Аффинная хроматография - Аберкромби Д.
ISBN 5-03-000480-7
Скачать (прямая ссылка):
9*
132
Глава 5
1.3. Иммобилизация ДНК на целлюлозе с использованием водорастворимого карбодиимида как конденсирующего агента
1) Перед присоединением целлюлозу промывают путем сус-пендирования 1%-ным (об./об.) метанольным раствором HCl в течение 3 сут при комнатной температуре; затем целлюлозу интенсивно промывают водой на пористом стеклянном фильтре и сушат на воздухе.
2) Готовят раствор ДНК или другого полинуклеотида в воде и доводят pH раствора до 6,0 путем добавления разбавленных растворов HCl или NaOH.
3) Раствор (2,5—250 мкмоль ДНК/мл) добавляют в 1U объема 0,2 M 2-морфолиноэтансульфокислоты (МЭС-буфер, pH 6,0), содержащего водорастворимый карбодиимид (в конечном растворе 100 мг карбодиимида/мл). Среди удобных растворимых в воде конденсирующих агентов можно назвать /г-толу-олсульфонат ^циклогексил-№-?-(ч-метилморфолиний)этилкар-бодиимида или хлорогидрат 1-этил-З-(3-диметиламинопропил)-карбодиимида.
4) Добавляют буфер, содержащий карбодиимид, к чистому сухому порошку целлюлозы и перемешивают до получения тонкой пасты.
5) Переносят пасту в чашку Петри и медленно сушат при комнатной температуре.
6) Через 2, 5, 8 и 14 ч чашку Петри помещают на 1 ч в закрытый резервуар, в котором поддерживается насыщенное давление водяного пара при комнатной температуре, а затем возвращают на воздух (в нормальную атмосферу).
7) Через 24 ч сухой порошок целлюлозы тщательно промывают с перемешиванием в большом объеме 0,05 M калийфос-фатного буфера (pH 7,0) и собирают продукт путем фильтрования через пористый стеклянный фильтр.
8) Эту операцию повторяют 3—5 раз, а затем промывают водой.
9) ДНК-целлюлозу отделяют путем фильтрования и сушат на воздухе. По другой методике целлюлозу можно суспендировать в 0,1%-ном (масс/об.) аммиаке между первым и вторым промыванием калийфосфатным буфером, благодаря чему удается удалить небольшие количества карбодиимида, который может присутствовать в качестве заместителя на урациловых, ти-миновых или гуаниновых основаниях.
1.4. Получение олиго(аТ)-целлюлозы
1) 2 мкмоль тимидин-5'-фосфата (в виде пиридиниевой соли) в безводном пиридине (3 мл) добавляют к 2-кратному избытку дициклогексилкарбодиимида.
Лиганды для иммобилизации
133
2) Добавляют несколько стеклянных шариков и встряхивают образовавшуюся тонкую пасту в течение 5 сут при комнатной температуре.
3) Затем к смеси добавляют промытую целлюлозу (5 г), высушенную при 1000C в течение 10 ч, безводный пиридин (50 мл) и дополнительно еще 2 ммоля дициклогексилкарбодиимида.
4) Эту смесь встряхивают 5 сут при комнатной температуре, отделяют целлюлозу путем фильтрования и промывают пиридином.
5) Подготовленную таким образом олиго(аТ)-целлюлозу суспендируют в 50%-ном (об./об) водном пиридине, перемешивание продолжают в течение 10 ч, отделяют модифицированную целлюлозу путем центрифугирования, а затем промывают теплым этиловым спиртом для полного удаления дициклогексилмо-чевины, накапливающейся в процессе синтеза.
6) Продукт на фильтре промывают дистиллированной водой, пока поглощение промывных вод при 267 нм не станет близким нулю.
Подобный препарат олиго(сГГ) -целлюлозы может быть получен в водной среде с использованием водорастворимых карбо-диимидов. Степень присоединения тимидин-5'-фосфата почти идентична ( — 60%) достигнутому в неводных условиях. В сущности водный метод почти ничем не отличается от метода, описанного для присоединения ДНК к целлюлозе путем конденсации с карбодиимидом; однако вместо водных растворов ДНК используется раствор тимидин-5'-фосфата в МЭС-буфере (pH 6,0).
1.5. Получение поли(и)-целлюлозы
Поли (U)-целлюлоза — одна из наиболее легко синтезируемых аффинных матриц, основанных на принципе гибридизации.
1) Промытую целлюлозу (1 г) добавляют к раствору продажной поли (U) (8 мг/мл) в дистиллированной воде.
2) Смесь тщательно перемешивают, продукт лиофилизуют и вновь суспендируют в 95%-ном (об./об.) этиловом спирте (10 мл).
3) Суспензию выливают в чашку Петри и облучают 15 мин с помощью УФ-лампы (30 Вт) на расстоянии 20 см от поверхности. Облучение приводит к поперечной сшивке между поли (U) и целлюлозной матрицей.
4) После облучения поли (U)-целлюлозу промывают дистиллированной водой, суспендируют и хранят в 0,01 M трис-НС1 (pH 7,5), содержащем 0,9 моль/л NaCl.
Хотя только -5% (0,4 мг) исходного количества поли (U) присоединяется к целлюлозе, полученный адсорбент обладает превосходной емкостью по поли (А). Колонка (0,8X20 см) с этим материалом удерживает не менее 1,5 мг поли (А).
134
Глава 5
1.6. Получение поли(ІІ), присоединенной к пористым стеклянным фильтрам
1) Раствор поли (U) (1 мг/мл) в дистиллированной воде наносят на пористые стеклянные фильтры диаметром 2,4 см (0,15 мл на каждый фильтр).
2) Фильтры сушат на воздухе при 37 °С, а затем облучают по 2,5 мин с каждой стороны, как описано при получении поли (U) -целлюлозы.
3) Затем фильтры промывают водой и сушат.
В этих условиях к каждому фильтру присоединяется —0,1 мг поли (U).
1.7. Получение поли(и), присоединенной к CNBr-активированной агарозе
