Биотехнология. Том 17 - Янулайтис А.А.
Скачать (прямая ссылка):
Молекулярный вес Есо57 I, определенный методом гель-фильтрации и электрофорезом в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях (в присутствии додецилсульфата натрия), равняется 104 000 и 108 ООО D соответственно. Совпадение молекулярной массы нативной и денатурированной формы Есо57 I указывало на то, что фермент состоит из одной поли-пептидной цепи. Отсутствие четвертичной структуры описано только для рестриктаз II типа [31, 54, 174, 210, 229, 290]. Согласно этому критерию к II типу следовало бы отнести Есо57 I. Однако, как уже отмечалось, разделить эндонуклеазную и метилазную активности не удалось, что указывало на объединение этих активностей в одну полипептидную цепь.
Рассмотренные структурные характеристики рестриктазы Есо57 I делают ее отличной от всех известных изученных в этом отношении рестриктаз. По другим признакам, таким как расщепление ДНК за пределами узнаваемого участка, неполное фрагментирование субстрата, стимулирующий эффект Адо-мет,
Есо57 I напоминает ферменты рестрикции III типа, но отличается от них отсутствием потребности в АТФ.
Рестриктаза Gsu I еще больше отличается от ферментов
III типа. В первую очередь это выражается в том, что она дает исчерпывающий гидролиз субстрата, чем напоминает ре-стриктазы II типа, однако от последних ее отличает стимулирующий эффект Адо-мет.
Из вышеизложенных данных также следует, что Есо57 I и Gsu I, несмотря на сходство их субстратной специфичности, тоже отличаются друг от друга.
На основе проведенных исследований было предложено рассматривать Gsu I и Есо57 I как представителей новых классификационных типов ферментов рестрикции и отнести их к
IV — Есо57 I и V — Gsu I типам [43, 289]. На данный момент эти типы по глубине характеристики уступают остальным (I—III), что указывает на необходимость проведения дополнительных исследований. Особенно это замечание относится к Gsu I.
Рассмотренные выше публикации представляют собой первые примеры более углубленного подхода к изучению кофак-торной потребности рестриктаз, что позволило выявить ферменты нового типа. Расширение аналогичных исследований позволило бы ответить на вопрос о распространении обнаруженных типов рестриктаз или наличии новых. Изучение этих вопросов имеет не только теоретический, но и практический интерес, так как таким путем могут быть найдены, например, способы активации специфических эндонуклеаз, что в конечном счете можно рассматривать как увеличение выхода целевого фермента, предназначенного для применения в качестве аналитического реагента.
В контексте настоящего обзора отдельного обсуждения заслуживает субстратная специфичность и характер расщепления ДНК сравниваемыми типами рестриктаз — показатель, имеющий наибольшее практическое значение, если задаться целью их использовать в качестве аналитических реагентов. Рестрик-тирующие эндонуклеазы всех типов отличаются исключительно высокой субстратной специфичностью — каждая узнает последовательность нуклеотидов строго определенной длины и состава. Основное различие между ними заключается в характере расщепления субстрата. В случае рестриктаз I типа это происходит в стороне от узнаваемого участка на большом расстоянии (более 1000 пар нуклеотидов) и случайным образом (179, 269), что исключает возможность использования этих ферментов для специфического фрагментирования ДНК.
Рестриктазы III и IV типов разрыв фосфодиэфирной связи ДНК производят на строго фиксированном расстоянии (24—26 и 14—16 нуклеотидных пар) в стороне от узнаваемого участка J69, 158, 292]. В результате образуется набор гомогенных фраг-
ментов субстрата. Однако использование этих ферментов в качестве аналитических реагентов не нашло распространения. Это объясняется тем, что никогда не наблюдается исчерпывающего гидролиза ДНК по всем участкам узнаваемыми рестрик-тазами III—IV типов. Поэтому получается набор фрагментов (хотя и ярко выраженных), характерный для неполного расщепления субстрата, который трудно поддается интерпретации. Аналогично субстрат фрагментируют немногочисленные эндонуклеазы, обнаруженные в эукариотических клетакх — у хламидомоны [100] и дрожжей [343, 388].
Вышеуказанными недостатками не обладают рестриктазы II типа. Нуклеотидные последовательности, узнаваемые этими ферментами, состоят из 4—8 нуклеотидных пар и отличаются вращательной симметрией второго порядка. Эти ферменты расщепляют ДНК полностью по всем узнаваемым участкам. Некоторые специфические эндонуклеазы способны узнавать ассиметричную последовательность нуклеотидов и расщеплять ДНК на расстоянии 5—13 пар оснований в сторону от узнаваемого участка. В других случаях узнаваемая последовательность нуклеотидов является прерванной — симметричные участки разделены любыми нуклеотидными парами. Однако, во всех случаях, вне зависимости от структурных особенностей, узнаваемого участка, наблюдается исчерпывающий гидролиз ДНК. Способность рестриктаз II типа высокоспецифично н исчерпывающе расщеплять ДНК на фрагменты, соответствующие по длине расстояниям между узнаваемыми участками, предопределило широкое использование этих ферментов в качестве аналитических реагентов в исследованиях, в той или иной мере связанных с изучением и характеристикой структуры ДНК и в опытах по генетической инженерии. Именно рассмотрению этих ферментов посвящен настоящий обзор.
