Биофизика - Владимиров Ю.А.
Скачать (прямая ссылка):
45
Реакция (6) приводит к образованию продуктов в электронно-возбужденном
состоянии и сопровождается испусканием квантов света
(хемилюминесценцией). Хемилюми-несцентный метод исследования применяется
в диагностике и в других целях.
2.5. МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ СВОБОДНЫХ РАДИКАЛОВ
Для обнаружения и идентификации свободных радикалов и свободнорадикальных
процессов используют ряд методов, которые можно условно разделить на
химические и физические.
Химический метод привитой сополимеризации основан на том, что некоторые
ненасыщенные соединения, такие как акриламид, винилпирролидон и др.,
могут полимери-зоваться в присутствии свободных радикалов:
R*+HaC=CH -R-CH2-CH ^-R-CHj-CH-CH -6н и т.д.
CONH2 CONHj 4. ioNH2 ioNH2
Акриламид У
Н2С=СН
conh2
Обычно используют меченные по 14С или 3Н мономеры. После сополимеризации
со свободными радикалами клеток полимеры остаются там, где они
образовались, и их локализацию в клетках и тканях можно изучать методами
биохимического разделения или гистоавторадиографии.
Наиболее прямой физический метод изучения радикалов - метод электронного
парамагнитного резонанса (ЭПР). Явление ЭПР было открыто Е. К. Завойским
в Казани в 1944 г.
Рассмотрим принцип метода ЭПР. Нескомпенсирован-ный магнитный момент
неспаренного электрона в свободных радикалах делает всю молекулу
парамагнитной. При отсутствии внешнего магнитного поля магнитные моменты
неспаренных электронов ориентированы хаотически. Если свободный радикал
помещается во внешнее магнитное поле, то эти магнитные моменты могут
ориентироваться только одним из двух способов: по полю (при этом энергия
электронов уменьшается) или .против поля (энергия возрастает) (рис. 11).
Разность энергий этих двух энергетических состояний определяется
выражением:
Д E = s-?-H, (2.13)
46
Рис. 11. Энергетические уровни (А), спектр поглощения (Б), первая
производная (В) спектра поглощения свободного радикала, испытывающего
влияние трех эквивалентных протонов.
А: 1 - без внешнего магнитного поля; 2, 6 - расщепление уровня во внешнем
магнитном поле: 2 - без взаимодействия с протонами; 3-5 - при
взаимодействии с одним, двумя и тремя эквивалентными протонами,
соответственно. Каждый протои расщепляет энергетический уровень на два.
Стрелки в кружках указывают ориентацию спииов иеспареиных электронов.
где g - гиромагнитное отношение (g-фактор), Р-магнетон Бора, Н -
напряженность внешнего магнитного поля.
Величина g-фактора колеблется в зависимости от вида свободного радикала в
пределах от 2,000 до 2,060. Для свободного электрона g - 2,0023. Если на
такой образец подействовать монохроматическим электромагнитным
излучением, то при условии Д Е = h\ (где h - постоянная Планка, v -
частота электромагнитного излучения) произойдет поглощение квантов
излучения и переориентация спинов, т. е. переход из нижнего
энергетического состояния в верхнее. Площадь под кривой поглощения (см.
рис. 11, Б) служит мерой количества содержащихся в исследуемом образце
свободных радикалов. По техническим причинам на ЭПР-спектрографах
регистрируют не сам спектр поглощения, а его первую производную по
47
напряженности внешнего магнитного поля (см. рис. 11, В). Для
качественного анализа свободных радикалов учитывают следующие параметры
спектров ЭПР: ширину полосы (ЛЯ), ее положение (g-фактор) и наличие
сверхтонкой структуры спектра (СТС). СТС возникает в результате наложения
на внешнее магнитное поле локальных магнитных полей, создаваемых
некоторыми ядрами атомов молекулы. В органических радикалах такими ядрами
являются, как правило, протоны, ближайшие к месту локализации
неспаренного электрона. На рис. 11 представлены спектры ЭПР, когда
неспаренный электрон находится одновременно под влиянием магнитных полей
трех эквивалентных протонов, создающих СТС. Суммарное магнитное поле,
действующее на неспаренный эл^трон в случае влияния одного протона, будет
расщеплять каждый энергетический уровень на два подуровня. В спектре ЭПР
будут наблюдаться уже не одна, а две полосы поглощения. Если влияют два
эквивалентных протона, то полос будет три, а если протонов три, то полос
четыре.
Преимуществом метода ЭПР является возможность идентифицировать свободные
радикалы и определять их концентрацию. Однако по чувствительности он
уступает другому физическому методу -хемилюминесценции, который основан
на регистрации свечения, сопровождающего химические реакции. Первые
указания на существование хемилюминесценции появились в работах А. Г.
Гурвича (1934), в которых он сообщал об обнаружении им УФ-излучения,
испускаемого растительными и животными клетками. В 1954 г. итальянские
ученые Коли и Фачини измерили сверхслабое свечение живых проростков
разных растений. Затем Ю. А. Владимиров и Ф. Ф. Литвин (1959) и Б. Н.
Тарусов, А. И. Журавлев и А. И. Поливода (1961) изучали сверхслабое
свечение различных животных и растительных объектов, применив в качестве
особо чувствительного прибора счетчик фотонов, созданный на основе