Методы культивирования клеток - Вахтин Ю.Б.
Скачать (прямая ссылка):
клеток, устойчивых к ядам и антиметаболитам. Клетки этого класса изучены более подробно и чаще используются в работах по генетике соматических клеток (см. обзоры: [1—3]).
Селекция клеток на устойчивость к ядам
и антиметаболитам. Общие принципы
Способы селекции. Как указывалось выше, генетическая природа используемых маркеров может быть различна. По-видимому, тип получаемых вариантов зависит от способа селекции. Следующие способы могут быть использованы для получения устойчивых к ядам вариантов соматических клеток: 1) массовую культуру чувствительных клеток обрабатывают ядом в определенной концентрации, так что большая часть клеток погибает и выживает незначительная часть популяции с частотой 10~4—10 6; такая селекция называется одношаговой, она не дает возможности получать высокоустойчивые варианты; 2) популяции клеток обрабатываются ядом в концентрации, при которой погибает только некоторая часть клеток и через несколько клеточных генераций почти все клетки становятся устойчивыми к яду в данной концентрации; при этом способе селекции, последовательно повышая концентрации яда и повторяя циклы, можно получить высокоустойчивые варианты, такая селекция называется многошаговой. Вариантом второго способа селекции может быть чередование культивирования клеток на среде с ядом и без яда. Подращивая выжившие после обработки ядом клетки на среде без яда, можно также получать высокоустойчивые варианты^* Изменения в геноме клеток, полученных в результате одношаговой и многошаговой селекции, могут быть различны. Во всех случаях очень важно, какое время вновь полученные варианты культивируются на среде с селективным агентом.
Посев клеток для последующего отбора. Примерная схема селекции устойчивых вариантов представлена на рисунке. При постановке эксперимента по такой схеме можно подсчитать спонтанную и индуцированную частоту обнаружения устойчивых вариантов. В зависимости от задач, стоящих перед исследователем, можно использовать отдельные элементы этой схемы.
При посеве клеток для последующего отбора следует помнить, что два параметра существенно влияют на частоту выявления устойчивых к ядам вариантов — концентрация селективного агента и исходная плотность клеточной культуры. Концентрацию селективного агента следует подбирать таким образом, чтобы клоны резистентных клеток обнаруживались с частотой, соответствующей мутационной (10“4—10”). Селективный агент при обработке клеток в заданной концентрации должен убивать основную массу клеток, не позволяя им размножаться. К агентам с таким немедленным действием в используемых концентрациях относятся 8-азагуанин, уабаин, пактамицин и некоторые другие. Однако ряд агентов, используемых в таких концентрациях, при которых клоны устойчивых клеток обнаруживаются с мутационной частотой, не способен сразу
f
Посев для определения эффективности клонирования (300 клеток, 60 мм чашки Петри, 3 повторности)
10-12 сут
фиксация, окраска и подсчет клонов
Посев для обработки мутагеном (3*10° клеток, 100 мм чашки Петри,
3 повторности)
2 сут Обработка мутагеном
Посев для определения эффективности клонирования (числа жизнеспособных клеток)
(300 клеток, 60 мм чашки Петри, 3 повторности)
Рост клеток в течение 7 сут, 2 пересева
Посев на селекцию (2-3)* 1O'3 клеток» 100 мм чашки Петри, Ю повторностей)
14-18 сут, смена среды каждые 4 сут
Фиксация, окраска и подсчет клонов или, если необходимо, выделение клонов
Посев для определения эффективности клонирования
10-12 сут
Фиксация, окраска и подсчет клонов
Посев на селекцию (2-3)* 10 ток, 100 мм чашки Петри, 10 повторностей
14-18 сут, смена среды каждые 4 сут
фиксация, окраска и подсчет клонов. Если необходимо выделение клонов
Примерная схема селекции генетических маркеров.
остановить размножение клеток. Оно на первом этапе селекции в присутствии селективного агента сильно усложняет генетический анализ, так как в этом случае нельзя исключить влияние селективного агента как индуктора на частоту выявления устойчивых вариантов и трудно оценить число устойчивых вариантов предсуществую-щих в исходной популяции клеток. Для определения оптимальной концентрации селективного агента для каждой концентрации 'засевают по 5 чашек Петри диаметром 60 мм, по 200 клеток в каждой, и обрабатывают различными концентрациями агента. Например, на одну группу из 5 чашек приходится 1 ¦ 10~3 М агента, на другую— 5 • 10 М, на третью— 1 • 10-2 М и т. д. Такой прием дает возможность оценить частоту выявления устойчивых вариантов до 10~3. Для определения более низких частот порядка 10-4—10~5 клетки высевают в 100 мм чашки Петри, после прикрепления клеток в среду добавляют селективный агент в заданной концентрации, на одну концентрацию агента можно взять 2—3 чашки. Среду во всех чашках меняют раз в 4 сут. Увеличение начальной плотности посева (больше 104—105 клеток на чашку) в этом случае может привести к изменению частоты выявления устойчивых вариантов. Известно, например, влияние плотности клеточной культуры на способность тиогуанин-резистентных клеток образовывать клоны в присутствии тиогуанин-чувствительных клеток, так называемые опыты по реконструкции. Небольшое количество резистентных клеток (200) смешивали с клетками дикого типа и с разной начальной плотностью (103—106 клеток на чашку) высевали в 100 мм чашки Петри для селекции. Клоны мутантных клеток не обнаруживались при плотности'свыше 5 • 105 клеток на чашку. При изменении начальной плотности посева от 103 до 105 не было обнаружено практически никакой разницы в числе обнаруживаемых клонов резистентных клеток [4]. К причинам ингибирования роста резистентных клонов в плотной культуре могут быть отнесены высокая токсичность продуктов распада гибнущих клеток ,и способность чувствительных клеток метаболизировать яды, превращая их в токсические для резистентных клеток соединения.
