Методы культивирования клеток - Вахтин Ю.Б.
Скачать (прямая ссылка):
Получение изолированных клеток сердца
Основным методом диссоциации ткани миокарда'является повторная щадящая обработка растворами протеолитических ферментов, проводимая в бескальциевой среде. Механическая дезагрегация сердца и использование хелатирующих агентов менее результативны и ввиду незначительного выхода жизнеспособных клеток практически не используются при получении материала для культивирования.
Спецификой этого этапа, отличающей его от аналогичной процедуры при работе с другимилшами клеток, является необходимость предотвращения гибели кардиомиоцитов вследствие необратимой контрактуры и нарушения автоматизма их сокращений при возвращении в среды с физиологической концентрацией кальция даже после кратковременного пребывания в бескальциевой среде. Это явление, описанное ранее на уровне целого органа и развивающееся в мышечных клетках сердца, получило название «кальциевого парадокса» (см. обзоры: [7, 8]). Кардиомиоциты эмбрионов и в меньшей степени новорожденных животных легче переносят изменения концентрации внеклеточного кальция, однако уже в течение первой постнатальной недели чувствительность клеток к Са2+ резко возрастает.
В последние годы интенсивно разрабатывались методы получения жизнеспособных мышечных клеток, толерантных к Са2+. Максимально возможное уменьшение контакта с бескальциевой средой [9, 10], введение в среду ДМСО, таурина [11] или трипсина на конечных этапах диссоциации ткани [12] увеличивают выживаемость кардиомиоцитов. Важным фактором в процессе изоляции клеток является температура. В большинстве указанных работ диссоциация ткани проводилась при 37 °С, что оптимально для активности используемых протеолитических ферментов, однако эта процедура осуществима и при комнатной температуре [10, 13].
Преинкубация ткани в бескальциевой среде в течение 1 ч при 22 °С до ее трипсинизации увеличивает устойчивость клеток к Са2+, а охлаждение уже изолированных клеток до 0 °С и перевод их в среду, содержащую Са2+, при 15 °С также значительно увеличивают выживаемость [13].
Ткань сердца диссоциируют перфузией органа 0.1—0.2 %-ным раствором коллагеназы, часто с добавлением гиалуронидазы, или обработкой протеиназами кусочков измельченной ткани без предварительной перфузии. Преимуществами перфузии являются свобод-
ный доступ кислорода, что важно для крайне чувствительных к гипоксии клеток сердца, и большой выход свободных клеток (до 60—70 % сырой массы ткани), недостатком — довольно большой расход дефицитных протеолитических ферментов. Сердце легко перфузируется ввиду малочисленности крупных кровеносных сосудов введением в аорту канюли, через которую подается раствор ферментов (схемы сборки перфузионного аппарата см.: [5, 14, 15]). Диссоциация про-теиназами кусочков ткани сердца без предварительной перфузии [16—18] выполняется по обычным для получения первичных культур схемам, однако при этом повышаются потери клеток вследствие их гибели.
Оптимальной, на наш взгляд, схемой получения устойчивых к Са2+ дифференцированных клеток сердца является разработка Нага и соавторов [19], учитывающая преимущества более ранних методик. Извлеченное сердце гепаринизированной перед забоем (1000 ед гепарина на 1 кг массы) крысы (200—300 г) помещают в 10 мл охлажденного до 0 °С бескальциевого физиологического раствора Кребса—Рингера (РКР) на фосфатном буфере, pH 7.4, содержащем 5 • 10~3 М глюкозы и 1 % бычьего сывороточного альбумина. Перфузионный аппарат наполняют 50 мл бескальциевого РКР, предварительно оксигенированного продуванием смесью 95 %
02 и 5 % СО2. Через аорту (извлекая сердце, сохраняют ее участок длиной около 5 мм) вводят канюлю и промывают сердце РКР в течение 15 мин при 37 °С (на эту процедуру обычно расходуется около 25 мл физиологического раствора); при этом сердце часто сохраняет.сократительную активность. Перфузию продолжают оксигенированным РКР, содержащим 0.1 % коллагеназы,1 0.1 % гиалу-ронидазы и 1 % бычьего сывороточного альбумина (к этому времени сокращения миокарда прекращаются). После окончания перфузии размягченную и потерявшую упругость ткань разрезают на 4 кусочка, удалив предсердия и крупные сосуды, затем повторно по 10— 15 мин до 3—4 раз инкубируют в растворе ферментов в РКР, отделяя клетки легким встряхиванием. Полученные фракции объединяют и отмывают центрифугированием (3—5 мин при 37 °С, 800 об/мин) на настольной центрифуге. Сходная методика получения изолированных клеток для культивирования описана Клэйкомом и Лэнсо-ном [14].
Для диссоциации ткани сердца наиболее пригодны препараты коллагеназы, обладающие трипсиноподобной активностью [10]. В наибольшей мере этому требованию отвечают ферменты, выпускаемые фирмами «Sigma» (коллагеназа, тип 1) и «Worthington» (коллагеназа, тип 1 и 2).
Жизнеспособность миоцитов оценивает по окрашиванию погибших клеток трипановым синим (0.4 %-ный раствор) либо биохимически [20] по их дыхательной активности и выходу в среду клеточных белков.
1 В оригинальной методике использовали 0.05 и 0.5 %-ные растворы коллагеназы, одиако указанная концентрация оказывается вполне достаточной.
