Методы культивирования клеток - Вахтин Ю.Б.
Скачать (прямая ссылка):
Суспензию костномозговых клеток приготовляют путем механической или ферментативной обработки. В первом случае костномозговую ткань в небольшом объеме среды многократно пропускают через шприц с иглами уменьшающегося диаметра, во втором — помещают в раствор трипсина (0.25 %) с виаказой на магнитную мешалку на 30 мин при комнатной температуре, а затем также пропускают через шприц. В обоих случаях полученную взвесь фильтруют затем через 4-слойный капроновый фильтр, центрифугируют в течение 10 мин при 800—900 об/мин, клеточный осадок ресуспензируют в среде а-МЕМ, доводя концентрацию до 1 • 108 ядерных клеток на 1 мл. Эксплантацию полученных суспензий производят
с использованием пористых желатиновых губок, которые служат каркасом для эксплантированных клеток. Кровеостанавливающие желатиновые губки нарезают на пластинки толщиной 1 мм и площадью 30—40 мм2 и помещают на влажную поверхность миллипоровых фильтров HAWP, предварительно разложенных над средой. Клеточную суспензию осторожно наносят на поверхность губки при помощи стеклянного капилляра или автоматической микропипетки. В одну губку помещают 5 • 106—1 • 107 костномозговых клеток.
Эксплантацию клеточных суспензий костного мозга можно проводить и без желатиновых губок. В этом случае суспензия наносится непосредственно на поверхность миллипорового фильтра HAWP, который затем накрывается фильтром AUFS; последний, являясь крупнопористым и проницаемым для клеток (как и губка), представляет собой хороший каркас для образования кости врастающими в него клетками.
Культивирование проводится при температуре 37 °С и pH 6.8—7.4. Питательная среда и газовая фаза обновляются 2 раза в неделю. Если не происходит сильного закисления среды, ее меняют не полностью, а на 2/з.
Фиксация и обработка культур. В последовательные сроки культивирования при смене среды производится фиксация части культур. Фильтр с растущей на нем тканью промывают средой 199 и фиксируют 80% этанолом (а для электронно-микроскопического исследования — глютаровым альдегидом). Затем часть культур используют для приготовления препаратов: окрашивают гематоксилином либо проводят на них гистохимические реакции. После этого фильтр целиком обезвоживают в спиртах, просветляют в ксилоле и заключают в канадский бальзам. Однако основной метод обработки органных культур заключается в приготовлении из них после гистологической обработки серийных срезов, на которых можно ставить гистохимические реакции и проводить окраску любыми гистологическими красителями.
Для изучения остеогенеза в культурах применяются две основные гистохимические реакции, дающие возможность охарактеризовать новообразованную кость и остеогенную ткань. Реакция ван Косса выявляет нерастворимые соли кальция и позволяет изучать морфологию минерализации кости. Реакция на щелочную фосфатазу по Гомори дает возможность судить о морфологии ранних стадий остеогенеза и необходима для характеристики остеогенной ткани на протяжении всего периода культивирования. Контроль к реакции Гомори позволяет определить локализацию ионов РО^- в составе гидроксилапатита костной ткаии. Реакция на щелочную фосфатазу по Гомори на срезах, предварительно декальцинированных ацетатным буфером, выявляет локализацию фермента вне зависимости от отложения солей кальция. Все эти реакции ставятся на серийных срезах, которые в совокупности дают достаточно полную информацию о ходе остеогенетического процесса.
Важно иметь в виду, что при всех перечисленных способах обработки культуры не отделяются от миллипоровых фильтров, кото-
рые не мешают приготовлению срезов и проведению гистохимических реакций. Красители, которые сорбируются на фильтре (например, азур-эозин), непригодны для окраски тотальных препаратов.
Следует подчеркнуть, что приготовление парафиновых срезов из культур, а которых остеогенная дифференцировка привела к образованию хорошо развитой минерализованной костной ткани, представляет существенные трудности. Чтобы избежать выкрашивания кости, богатой нерастворимыми солями кальция, культуры приходится предварительно декальцинировать, что в дальнейшем не позволяет производить на срезах реакцию ван Косса.
Обработка культур для электронно-микроскопического исследования проводится по общепринятым методам.
Последовательные стадии костеобразования в культуре. При эксплантации в органные культуры фрагментов костного мозга, выделенных из медуллярной полости бедренной кости мыши, за 20—25 су г культивирования может происходив» полная дифференцировка стро-мальной ткани — образование кости. Новообразованная кость располагается в виде плоской пластины, которая занимает центральные участки эксплантата и часть примыкающей к ним зоны роста. Морфологическое изучение культур последовательных сроков позволяет судить о динамике костеобразования in vitro. В культурах костного мозга мыши очаги остеогенеза появляются 'на 16—20-е сутки в центре эксплантата и участках с наибольшей клеточной плотностью. Здесь обнаруживаются тонкие костные балки, ориентированные вдоль мил-липорового фильтра. Лежащие на их поверхности остеобласты пра-являют высокую активность щелочной фосфатазы и имеют морфологию, характерную для остеобластов in situ. По мере культивирования происходит разрастание костной ткани (утолщение кости) и к 26—30-м суткам слияние костных балок в единую пластину с замурованными остеоцитами. В присутствии глицерофосфата происходит минерализация основного вещества новообразованной костной ткани.
