Молекулярная биология клетки - Уилсон Дж.
ISBN 5-03-001999-5
Скачать (прямая ссылка):
утверждают, что физический размер ядерной поры (кажущийся диаметр 9 нм)
благоприятствует активному транспорту, однако такую аргументацию нельзя
считать удовлетворительной, поскольку форма молекул для большинства
ядерных белков неизвестна.
В одном из экспериментов, проведенном для разрешения этой
проблемы, использовали радиоактивный нуклеоплазмин - крупный пентамерный
белок, участвующий в сборке хроматина, а также составляющие его элементы.
В разных вариантах опыта в цитоплазму или в ядро ооцита лягушки были
инъецированы: нативный белок, "головки" молекулы, "хвосты" молекулы и
головки плюс один хвост (рис. 8-4). Все элементы молекулы нуклеоплазмина,
кроме головок, накапливались в ядре, если были введены в цитоплазму, и
все они оставались в ядре, если были введены в него.
А. Какая часть молекулы нуклеоплазмина ответственна за его локализацию
в ядре?
Б. Каким образом с помощью этих опытов можно определить механизм
переноса: активный ли это транспорт, который запускается сигналом для
переноса в ядро и идет через поровый комплекс ядерной оболочки, или же
пассивная диффузия, при которой накопление белка в ядре происходит за
счет связывания с компонентом ядра.
pNL"
GAL
.Ядерный.
белок
EcoRI
Сигнал
отсутствует
Рк. 8-5. Две плазмиды для иссле-• дования транспорта в ядро у дрожжей
(задача 8-12).
8-12 Вы приступили к работе в лаборатории, где занимаются изучением
механизма ядерного транспорта у дрожжей. Ваш руководитель-сотрудница,
известная своими оригинальными идеями,-предложила вам очень перспективный
план. Он позволит провести генетический отбор условно-летальных мутантов
по механизму ядерного транспорта.
Руководитель предоставила вам две плазмиды (схематически
изображенные на рис. 8-5). Каждая из них содержит гибридный ген,
находящийся под контролем регулируемого промотора. Гибридный ген
образовался в результате слияния гена, продукт
106 Глава 8
которого нормально импортируется в ядро, с геном для рестрик-тазы
EcoRI. В плазмиде pNL+ закодирован функциональный сигнал для ядерного
импорта, а в плазмиде pNL" -тот же сигнал в нефункциональной форме.
Промотор из дрожжевого гена GAL1 обеспечивает транскрипцию гибридного
гена при особом условии: в среде для культивирования должна быть
галактоза.
Следуя советам руководителя, вы ввели эти плазмиды в дрожжи (в
отсутствие галактозы), а затем исследовали рост трансформированных
дрожжей на среде с глюкозой и на среде с галактозой, Результаты
эксперимента представлены в табл. 8-1. Вы не помните, что говорила
руководитель по поводу ожидаемых результатов, но знаете, что от вас ждут
сообщения на лабораторном семинаре в конце недели. Почему дрожжи с
плазмидой pNL+ растут в присутствии глюкозы, но гибнут в среде с
галактозой?
8-13 Когда вы поняли, почему плазмида pNL+ (рис. 8-5) вызывает гибель
клеток в среде с галактозой, для вас становится ясным, каким образом ваш
руководитель намеревается использовать свойства этой плазмиды для отбора
мутантов с изменениями в механизме ядерного транспорта. Вы начинаете
также понимать, почему она подчеркивала, что мутанты должны быть условно-
пе-тальными. Поскольку ядерный транспорт необходим для клетки полностью
дефектный мутант не смог бы расти и его невозможно было бы исследовать.
Напротив, условно-летальные мутанты могут хорошо расти при тех или иных
условиях (разрешающие условия); при других условиях (ограничивающие
условия) проявляется дефект клеток, который можно тогда исследовать.
На основе этой общей стратегии вы разрабатываете схем) отбора
клеток, мутантных по механизму ядерного транспорта и чувствительных к
температуре (ts). Вы хотите найти мутанты, которые хорошо растут при
низкой температуре (разрешающи условия), но плохо-при высокой температуре
(ограничивающю условия). Вы планируете индуцировать мутации в клетках с
ШШ мидой pNL+ при низкой температуре, а затем перевести ш в условия
высокой температуры и среду с галактозой. Bt считаете, что при
ограничивающей температуре мутанты по ядер ному транспорту не будут
поглощать белок-убийцу, кодируемы! плазмидой pNL+, а потому не погибнут.
В нормальных же клетка) будет происходить транспорт белка-убийцы в ядро,
и они погиб нут. После инкубации в течение 1-2 ч при высокой температуре,
з время которой нормальные клетки должны погибнуть, вы намере ваетесь
понизить температуру и поместить выжившие клетки в пластинки питательного
агара, содержащего глюкозу. Вы полага ете, что мутанты по ядерному
транспорту реактивируются npi низкой температуре и дадут колонии.
Когда вы показываете схему опыта руководителю, она с воод)
шевлением одобряет ваш план, однако отмечает в нем существе! ный
недостаток, который может помешать выделению мутанта по транспорту в
ядро. Подсказывать руководитель не хочет. Он считает, что студенты лучше
овладевают предметом, когда дейст вуют самостоятельно.
