Молекулярная биология клетки - Уилсон Дж.
ISBN 5-03-001999-5
Скачать (прямая ссылка):
G
тид. Синтез смешанных олигонуклеотидных зондов осуществляется более
просто: за один цикл добавляют не один нуклеотид, а два, три или все
четыре-как считают нужным. Синтез сложной смеси не более труден, чем
синтез чистого олигонуклеотида.
5-53 Три олигонуклеотида, которые можно использовать, чтобы получить
желаемые изменения в белке, представлены на рис. 5-62. Лучше, чтобы
участок неправильного спаривания находился в центре олигонуклеотида.
Заметьте, что все три олигонуклеотида имеют одинаковую основную
последовательность (см. рис. 5-44), комплементарную последовательности
одноцепочечной ДНК вируса М13. Чтобы осуществить сайт-направленный
мутагенез, олигонуклеотиды следует гибридизовать с кольцевой
одноцепочечной ДНК из рекомбинантного вектора (как показано на рис. 5-
62), а затем достроить с помощью ДНК-полимеразы вторую цепь.
Двухцепочечную ДНК следует затем ввести в клетки бактерий, и таким
образом будет получен желаемый мутант.
5'TAGAGACCCGGGGGGCGGCGT 3'
GAATCTCTGGGC CCCGCCGCAGTAG \ /
GT
Q-Деления
ДО
*
5'TAGAGACCCGGGCGGCGTCA 3'
GAATCTCTGGGCCCGCCGCAGTAG (GTCI
5-54 Последовательность клонируемой ДНК показана на рис. 5-63. Стоп-
кодоны подчеркнуты и помечены цифрами 2 и 3, чтобы указать их рамку
считывания. Как видно из этого опыта, гель для определения
последовательности следует анализировать очень тщательно; пропуск одного
нуклеотида будет иметь пагубные последствия при определении открытой
рамки считывания. Чтобы застраховаться, лучше определять
последовательность для обеих цепей ДНК. Поскольку они комплементарны, все
ошибки будут тотчас обнаружены.
Рис. 5-62. Три олигонуклеотида для сайт-направленного мутагенеза (ответ
5-53).
Рис. 5-63. Нуклеотидная и аминокислотная последовательности
клонированного гена (ответ 5-54). Стоп-кодоны подчеркнуты. Аминокислоты
закодированы в рамке считывания 1.
YKLDNQFELVFVVGFQKILT
GTAia&ACTGGACAACCAGTTCGAGCTGGTGTTCGTGGTCGGTTTTCAGAAGATCCXMC 3
2
LTYVDKLIDDVHRLFRDKY
GCTGACGTACGTAGACAAGTTGATAGATGATGTGCATCGGCTGTTTCGAGACAAGTAC
2 2 2 2 3
Плазматическая мембрана
Липидный бислой
6-1
A. липидный бислой
Б. фосфолипиды; холестерол; гликолипиды
B. амфипатические
Г. полярная; гидрофобные углеводородные (жирные кислоты)
Д. мицеллы; бислойные пленки
Е. липосомы; черные (черными мембраны называют потому, что
взаимогасящая интерференция света, отраженного от двух поверхностей,
делает их как бы черными; мыльные пузыри при белом освещении показывают
интерференционные цвета, зависящие от толщины пленки)
Ж. спиновая метка
3. фазовый переход
И. гликолипиды
К. галактоцереброзид; миелиновая
Л. ганглиозиды, GM1
6-2
A. Правильно.
Б. Неправильно. Липидные бислои-термодинамически стабильные структуры.
Энергия исходно необходима для образования различных липидов, но для
поддержания бислойного расположения этих липидов в мембране никакой
дополнительной энергии не требуется.
B. Правильно.
Г. Неправильно. Текучесть мембраны существенно зависит также от длины
боковых цепей жирных кислот и числа содержащихся в них г/ис-двойных
связей.
Д. Правильно.
Е. Неправильно. Для мутантных клеток, которые не могут синтезировать
холестерол, необходимо его присутствие в культуральной среде. В
отсутствие холестерола их мембраны быстро разрушаются.
Ж. Неправильно. Холиновая группа головы действительно заряжена
положительно, но она связана с остальной частью липида фосфо-диэфирной
связью, а фосфатная группа несет при физиологических значениях pH
отрицательный заряд. Следовательно, фосфатидил-холин не несет чистого
заряда.
3. Правильно.
И. Правильно. (Гликолипиды синтезируются в полости аппарата Гольджи и
не могут преодолевать мембрану по механизму транс-
312 Глава 6
\
н\ о
1 \ "
О Н - С - О - С- R,
11 п
r2-С^-О-С -Н О /и
У \ \ у
А, н - С - О-Р - О- Холин
1 / 1 н/ о
с
Рис. 6-15. Специфическое расщепление несколькими фосфолипазами (ответ 6-
4). Чувствительные связи указаны стрелками. Специфические фосфолипазы
обозначены буквами: Aj-фосфолипаза А,; К2-фосфолипаза А2; С-фосфолипаза
С;
D-фосфолипаза D.
локации. Ферменты, присоединяющие углеводы к липидам, в цитоплазме в
свободном состоянии не обнаружены.)
6-3 Каждую микроворсинку можно представить в виде цилиндра диаметром 0,1
мкм и высотой 1,0 мкм. По отношению площади боковой поверхности цилиндра,
который представляет собой новую мембрану (относительно ровной мембраны,
