Молекулярная биология клетки - Уилсон Дж.
ISBN 5-03-001999-5
Скачать (прямая ссылка):
взаимодействует с актином лишь тогда, когда его легкая щ фосфорилирована.
Фосфорилирование регулируется изма ниями внутриклеточной концентрации Са2
+ , эффект котор опосредуется кальмодулином. Вы выделили из гладкой мьп
киназу легких цепей миозина, но активность ее одинаю в присутствии и в
отсутствие Са2 + . Ваш коллега предлап добавить ингибиторы протеаз, чтобы
быть уверенным в сох| нении интактности киназы в процессе выделения. При
та] условиях получения киназная активность в экстракте обнар; вается
только в присутствии Са2+ и кальмодулина.
Вы проводите частичную очистку киназы методами п фильтрации- и
ионообменной хроматографии, а затем, ш зуясь методом аффинной
хроматографии, пропускаете препа| через колонку с кальмодулином в
присутствии Са2+. К bi радости, вся киназная активность сорбируется на
коло! а затем количественно элюируется с нее при промывке paci ром ЭГТА-
агента, хелатирующего Са2 + . Как видно из та!
Межклеточная сигнализация 229
Таблица 12-2. Активность киназы легких цепей миозина, выделенной в
отсутствие и в присутствии ингибиторов протеаз (задача 12-22)
Способ выделения Добавки к реакционной Активность, %
среде
Без ингибиторов Без добавок 50
Без ингибиторов Са2 + 50
Без ингибиторов Кальмодулин 50
Без ингибиторов Са2+ + кальмодулин 50
С ингибиторами Без добавок 1
С ингибиторами Са2 + 1
С ингибиторами Кальмодулин 1
С ингибиторами Са2 + + кальмодулин 100
12-2, очищенная киназа ведет себя, как и ожидалось; ее активность
полностью зависит от наличия Са2 + и кальмодулина. Воодушевленные таким
успехом, вы пытаетесь "реанимировать" первоначально выделенный вами
препарат фермента, пропуская его через колонку с кальмодулином. К вашему
удивлению, киназа проходит через колонку независимо от того, добавлен Са2
+ или нет.
A. Как вы объясните, почему первоначально выделенный фермент был
активен независимо от присутствия Са2 + и кальмодулина и не задерживался
на колонке с кальмодулином при аффинной хроматографии?
Б. Опишите последовательность молекулярных событий, приводящих к
сокращению гладких мышц. Начните со входа Са2 + в цитоплазму.
B. Как вы считаете, можно ли использовать аффинную хроматографию на
колонке с кальмодулином в качестве первой стадии очистки киназы легких
цепей миозина?
12-23 Главная функция тромбоцитов-это регуляция свертывания крови. Когда
тромбоциты оказываются в контакте с состоящей из коллагеновых волокон
базальной мембраной поврежденного кровеносного сосуда или с
образовавшимся сгустком фибрина, они изменяют свою форму-из округлых
гладких становятся покрытыми "шипами" (отростками)-и прилипают к
поврежденному участку. Тогда же они начинают секретировать серотонин и
АТР, стимулирующие аналогичные изменения во вновь прибывающих
тромбоцитах, что приводит к быстрому образованию тромба. Реакция
тромбоцитов регулируется путем фос-форилирования белков. В связи с этим
тромбоциты содержат в больших количествах две протеинкиназы -
протеинкиназу С и киназу легких цепей миозина; первая инициирует выброс
серотонина, вторая-изменение формы тромбоцита.
При активации тромбоцитов тромбином происходит фос-
форилирование легких цепей миозина и неидентифицированно-го белка с мол.
массой 40 ООО Да. Обработка тромбоцитов кальциевым ионофором приводит к
фосфорилированию только легких цепей миозина, обработка же
диацилглицеролом - к фосфорилированию только белка с мол. массой 40 кДа.
Эксперименты с использованием кальциевого ионофора и диацилгли-церола в
различных сочетаниях показали, что степень фосфори-лирования указанного
белка 40 к Да зависит только от концентрации диацилглицерола (рис. 12-10,
А), высвобождение же
230 Глава 12
А. Фосфорилирование
Диацилглицерол, мкг/мл
Б. Выброс серотонина
Диацилглицерол, мкг/мл
Рис. 12-10. Влияние обработки тромбоцитов Са2+-ионофором и
диацилглицеролом на фосфорилирование белка 40 кДа (А) и на выброс
серотонина (Б) (задача 12-23). Черные кружки в присутствии кальциевого
ионофора, светлые-в его отсутствие.
серотонина зависит как от диацилглицерола, так и от ионофор
кальция (рис. 12-10, Б).
А. Исходя из этих наблюдений опишите цель происходящих t норме
молекулярных событий, ведущих к фосфорилированш легких цепей миозина и
белка с мол. массой 40 кДа. Объясните; как влияет обработка
диацилглицеролом и кальциевым ионо фором на эти реакции.
Б. Почему для секреции серотонина необходимы одновременш и ионофор,
и диацилглицерол?
12-24 Удобным объектом для изучения компонентов, влияющих ш
внутриклеточный уровень Са2 + , служат яйца морского ежа В норме
связывание со сперматозоидом вызывает увеличат внутриклеточной
концентрации Са2+, которое, в свою очереди стимулирует экзоцитоз тысяч
