Аффинная хроматография - Туркова Я.
Скачать (прямая ссылка):
|- NHCHtCH4CH4NHCHzCHzCH4NHCOCH4CH4?-Q-^~[ 5 l+R-NHj 0
|-NHCH 4CH4C HaNH CHjCH 4CH4 NH COCH^CH N H R В
Диаминодипропиламиноагароза обрабатывается янтарным ангидридом в
насыщенном Na-боратном буфере для получения соответствующего
сукцинилированного производного А. Последний вводят в реакцию с N, N'-
дициклогексилкарбодиимидом и N-окси-сукцинимидом в диоксане для получения
активного эфира агарозы Б. После удаления дициклогексилмочевины и
непрореагировавших реагентов (промывание диоксаном и метанолом) активный
эфир агарозы вводят в реакцию в водной среде с лигандами или белками для
получения устойчивого производного с амидной связью с носителем В.
Используя этерификацию карбоксильных групп СН-сефарозы 4В (т. е.
сефарозы, к которой после активации бромцианом привязана е-
аминокапроновая кислота) N-оксисукцинимидом фирма Pharmacia (Швеция)
производит "активированную СН-сефарозу 4В". Для связывания на этом
производном рекомендуется область pH 5-10; оптимальное значение pH равно
8, Преимущество низких pH состоит в уменьшении гидролиза эфиров, однако
при этом скорость реакции снижается. Для связывания не могут
использоваться буферные растворы, содержащие аминокислоты (трис-буфер или
глициновый). Производные агарозы, содержащие N-оксисукцинимидный эфир,
выпускаются также фирмой Bio-Rad Labs. (США) под названием аффигель 10.
Ковалентное присоединение белков к полисахаридным носителям, в том числе
к агарозе, с помощью бензохнноиа [5]
Механизм активации и связывания по этому методу, вероятно, можно описать
схемой
Нерастворимые носители и методы иммобилизации Лиганда
199
О он н
Связывание белков на активированных гелях происходит при щелочных pH.
Сывороточный альбумин наиболее полно связывается при pH 8; количество
связанного химотрипсина увеличивается с ростом pH; при pH 10 связывание
максимально.
Аффинные лиганды, которые содержат свободные карбоксильные группы, могут
быть связаны с аминоэтилагарозой при помощи водорастворимых
карбодиимидов. Этот метод детально обсуждается в разд. 8.3,
8.2.5. Сополимер этилена и малеииового ангидрида
Иммобилизация аффинных лигандов на сополимере этилена и малеинового
ангидрида (ЭМА) рассмотрена в обзоре Гольдштейна [23]. Метод связывания
ферментов на таком сорбенте разработан Левиным и др. [40]. Белок
присоединяется к ангидридным группам полимера своими аминогруппами
200
Глава 8
Когда аффинный лиганд привязан к матрице (например, в 0,2 М К-фосфатном
буфере, pH 7,5), карбоксильные группы освобождаются (либо в результате
связывания с белком, либо из-за гидролиза в водной среде), и оии придают
сорбенту полианионные свойства.
Сополимер этилена и малеинового ангидрида производится фирмой Monsanto
(США). Фирма Miles-Yeda к этому сополимеру привязывает ферменты -
трипсин, химотрипсин, папаин и суб-тилопептидазы А и В и выпускает
соответствующие препараты под названиями энзайт-ЭМА-фермент. Эти
препараты характеризуются высоким содержанием (.~ 60%) связанного
фермента. Свойства ферментов, связанных с ЭМА-носителями, интенсивно
исследовались [24, 67]. Этот носитель со связанными протеиназа-ми
использован главным образом для приготовления ряда ингибиторов
протеолитических ферментов [18, 20, 21, 28] и со связанными ингибиторами
- для выделения протеиназ [19].
8.2.6. Полиакриламидные носители и их производные
Полиакриламидные гели построены из углеводного скелета, к которому
присоединены амидные группы
-CHt-CH-CH^-CHCHfc-CH-
СО-Щг CO-NHj CO-NHj,
Главный производитель полиакриламидных гелей -фирма Bio-Rad Labs.-
выпускает их под названиями биогели Р; получают эти гели сополимеризацией
акрнламида и N'N-метиленбисакрил-амида. Биогели Р имеют различные размеры
пор: биогель Р-2- предел исключения молекулярной массы 1800, биогель Р-
300- предел исключения 400000. Все марки биогеля выпускаются с размерами
гранул 50-100, 100-200, 200-400 и 400 меш. Наряду с перечисленными фирма
производит ионообменные производные этих гелей, например слабокислъгй
катионообменник биогель СМ, а также промежуточные продукты для получения
сорбентов для аффинной хроматографии, такие, как аминоэтильное и
гидразидное производные биогелей Р-2 и Р-60.
Для привязки аффинных лигандов, главным образом ферментов, фирма Koch-
Light (Англия) производит энзакрилы. Энзакрил АН является гидразидным
производным полиакриламидных гелей, а энзакрил АА - полиакриламидный
гель, содержащий ароматические амины. Энзакрилполиацеталь-сополимер
диметил-ацеталя N-акрилоиламиноацетальдегида с Ы.ЬГ-метиленбисакрил-
амидом; энзакрилполиацеталь присоединяет белки, образуя связи с их ЫНг-
группами, Энзакрилполитиол - поперечносшитый сополимер акрнламида и N-
акрилоилцистеина. В присутствии окислителей он связывает белки, реагируя
с их SH-трутшами.
Нерастворимые носители и методы иммобилизации лиганда____________201
Для введения SH-rpyim в фермент рекомендуется реакция фермента с
тиолактоном N-ацетилгомоцистеина.
10 мг этого реагента растворяют в 0,5 мл карбонатного буфера (pH 10,6) и
