Аффинная хроматография - Туркова Я.
Скачать (прямая ссылка):
буфера на колонку поток останавливался на 15 а затем хроматография
в-1 "обновлялась. При определениях
белка собирали фракции по 1 мл; для установления специфического
связывания ['*Ч]инсул1г-на нсполыояалась методика с полчУТил( нглнколем.
рецепторов с помощью аффинной хроматографии, ряд мембранных фрагментов со
специализированной рецепторной активностью был выделен. В табл. 11.1
приведены выделенные рецепторы и аффинные лиганды. В разд. 5. 3. уже
рассматривалось выделение сс-бунгаротоксинсвязывающих мембранных
компонентов из электрического органа Torpedo calijornica (рис. 5.9).
Аффинная хроматография рецептора инсулина, солюбилизированного с
детергентом, с использованием диаминодипропиламиносукцинил-Ы-фе-
нилаланил-инсулин - агарозы показана на рис. 6.9. [8].
124
Глава 6
Ограниченные запасы витаминов и гормонов в животных привели к развитию
механизмов адсорбции, транспорта и консервации этих веществ в следовых
количествах. В таких процессах важную роль играют специфические
транспортные или связывающие белки, предотвращающие быстрое выведение
витаминов и гормонов с мочой, которое происходило бы, если витамины и
гормоны не были бы связаны в плазме в соответствующих комплексах.
Связывающие белки присутствуют в очень низких концентрациях. Например,
белки, прочно связывающие витамин В[2, транскобаламины I и II, находятся
в плазме крови человека в концентрациях соответственно 80 и 20 мг на 1000
л. Однако они обычно имеют высокое сродство к комплементарным витаминам и
гормонам. Константы диссоциации этих комплексов находятся в интервале от
10-7 до 10 16 моль/л [35]. Из-за низких концентраций эти белки нельзя
выделить классическими методами очистки; наличие специфических
взаимодействий с высоким сродством позволяет использовать аффинную
хроматографию, которая до* пускает работу с большими объемами исходного
материала. Как и для взаимодействий антитело-антиген, трудности
заключаются в последующем выделении белка из комплекса с аффинными
сорбентами.
Например, для того чтобы снять ааидин с биоцитин - сефарозы, использовали
6 М гуанидинхлорид в солянокислом растворе (pH 1,5) [10]. В табл. 11.1
приведены и другие примеры выделения связывающих и транспортных белков с
использованием аффинных лигандов.
6.6. ВЫДЕЛЕНИЕ SH-БЕЛКОВ И ПЕПТИДОВ
Для выделения белков и пептидов, содержащих свободные SH-группы,
целесообразно использовать высокое сродство меркапто-соединений к ионам
тяжелых металлов, главным образом ртути. В табл. 11.1 дан ряд примеров
выделения как белков, так и пептидов, основанного на образовании
упомянутого комплекса. На рис. 6.10 приведены результаты выделения SH-
протеазы из неочищенного экстракта бобов, осуществленного в колонке на
оксиал-килметакрилатном геле, содержащем ртутное производное мета-
криланилида [57]. SH-протеазу с оптимумом протеолитической активности при
pH 8 можно выделить из смеси п ротео лети чески х ферментов этим способом
за одно хроматографическое разделение. После удаления неактивного
материала гель-фильтрацией через сефадекс G-75 сразу получается
гомогенная протеаза [58].
Для выделения папаина, бромелаина, химопапаина, фицина, пропапаина,
креатинфосфокиназы и фосфофруктокиназы Брокле-хорст и др. [6]
использовали полимер с 2,2/-ди,пиридилдисульфи-
Выбор аффинных лигандов
125
дом. Выделение белка ESH, содержащего тиольную группу, осуществляется по
следующей схеме:
c3-s-s"0 " " Нч
a i^SH ------------¦-----|-s-s-^Ч + s
2 (z-pj-S'S-г-ру) $ \=/
Тиол- (ру-г-SHj
сефароза.
6 ^S-S^y + ESH a- I^S-S-E + S=f^
SH-fo/ГОК н
в |-------- RSH" |^SH + ESH + R-s-S-R
Между выделяемым белком и нерастворимым носителем образу-ется ковалентная
связь, которая после отмывки несорбированного материала расщепляется под
действием избытка низкомолекулярного тиола RSH. Поскольку имеет место
образование ковалентной связи, этот тип хроматографии называется
"ковалентной хроматографией" и рассмотрен в разд. 7.2.
Егоров и др. [17] использовали тиол-дисульфидный обмен на глутатион-2-
пирндилдисульфид - агарозе в качестве быстрого и специфического метода
для выделения тиолсодержащих пептидов из крупных белков. Парвальбумин
(109 аминокислотных остатков и один цистеиновый), меркаптальбумин {565
аминокислотных остатков и один цистеиновый) и церулоплазмин (1065
аминокислотных остатков и три цистенновых) присоединялись к
модифицированному носителю через дисульфидные мостики. Иммобилизованные
белки расщеплялись протеолитическими ферментами. После промывки пептиды,
содержащие тиольную группу, элюировались при помощи восстанавливающего
агента, затем проводился препаративный электрофорез на бумаге, который
оказался достаточным для получения чистых пептидов с хорошим выходом.
Преимущество этого метода состоит в том, что он дает возможность из
родственных белков очень просто получать пептиды-гомологи.
Среди ионов тяжелых металлов для образования комплексов с тиольными
группами белков и пептидов следует упомянуть Zn2+ и Си2+. Для метода,
