Биология в 3 томах. Tом 3 - Тейлор Д.
ISBN 5-03-003687-3
Скачать (прямая ссылка):
При обработке ДНК донорного организма рестриктазами рассчитывают на то, что один из фрагментов будет случайным образом содержать полную копию нужного гена и ничего больше.
БОТАНИКА
ММА им. И.М. Сеченова
Д. Тейлор, Н. Грин, У. Стаут. БИОЛОГИЯ, т. 3
220
Глава 25
Фермент
EcoR\
Сайты разрезания ДНК
Липкие Г А &
ie концы
Водородные связи между основаниями
Происхождение названия
Есо — от названия бактерии Е. coli;
R - рестрикционный фермент;
I - первый рестрикционный фермент из Е. coli
Сахарофосфатные связи разрезаются ферментом
H/ndlll
А, А Г Ц T T
L--_. _ .
T T Ц Г А ,А
HM: из бактерии Haemophilus influenzae III: третий рестрикционный фермент, обнаруженный в этой бактерии
Нра\
из Haemophilus parainfluenzae
HinoW
Г T ц Ц А г
Г А Ц Ц T Г
ватНІ
Г і Г A T ц ц
L _______ _
Ц Ц T А Г ! Г
из Bacillus amyloliquefaciens
Рис. 25.2. Некоторые обычно используемыерестриктазы. EcoRl, Hindlll и ВатШ делают зигзагообразные (ступенчатые) разрезы в ДНК, оставляя «липкие концы». Липкий конец, образованный, к примеру, ЕсоШ, может соединиться с другим липким концом, образованным ЕсоШ. HindU и Нра\ оставляют тупые концы. Более детально представлены схемы для ЕсоШ и Нра\.
Этот неспецифичный метод выделения генов называют методом дробовика. Наиболее трудная задача при его использовании — найти фрагмент, который несет нужный ген; эта проблема обсуждается в разд. 25.1.3.
Прерывистые гены
Использование обратной транскриптазы или химический синтез гена имеют преимущество над методом дробовика, поскольку получаемый при этом ген не является «прерывистым». Прерывистые гены содержат один или несколько участ-
БОТАНИКА
ММА им. И.М. Сеченова
Д. Тейлор, Н. Грин, У. Стаут. БИОЛОГИЯ, т. 3
Молекула ДНК
Человек с
Шимпанзе
Карликовый шимпанзе С
Горилла
Орангутан I
Гиббон CZ
1
1 2
1 2
I 2
±=4
1 2
1
21 2
21
К:
2 2
2
-І——,
^-;-L...... -.-3.-.-wJ
2 1
I т
*
2
і-
......— ^ ¦ - ¦
1
Я_
2
I-
1
—T-
_~.____1_._^_i
x_
2
J-
_____l._^__„
,_-_.___._. ... i
LJ
IO
20
ДНК, тысячи nap нуклеотидов
ЗО
40
Рис. 25.3. Использование рестриктаз для разрезания ДН К и получения рестрикционных фрагментов разной длины. На этом рисунке участок ДНК, который содержит два гемоглобиновых гена разных приматов, обрабатывали двумя рестриктазами. Фермент I обозначен знаком T1 фермент 2 — знаком •i . Фермент I разрезает ДНК человека на два фрагмента, а фермент 2 — на пять фрагментов. Длины этих фрагментов, а также фрагментов, полученных при совместной обработке обоими ферментами, позволяют локализовать положение разрезов (сайтоврестрикции) относительно друг друга. На основе этих данных строят «рестрикционную карту», которая изображена на схеме. Чем больше рестриктаз используется для построения карты, тем более детальной она получается. Обратите внимание на то, что чем ближе родство между видами, тем более сходны их ДНК и расположение в них сайтов рестрикции. !Схема построена на основе рис. 7—4, с. 294, Molecular biology of the cell, 3rded., B. Alberts et al. (1994) Garland./
Рас. 25.4. Гель-электрофорез, используемый для разделения фрагментов ДНК различной длины. Фрагменты образуются при разрезании ДНК одной или несколькими рестриктазами. Самые большие фрагменты движутся медленнее всех, так как им гораздо труднее пройти через поры в геле. На фотографии они расположены поблизости от стартовых лунок в геле.
Экзон Интрон Экзон
ДНК
прерывистого
[расщепленного)
гена
Транскрипция
мРНК
Интрон удаляется и разрушается
«Зрелая» мРНК используется для синтеза белка
Трансляция
Белок
Рис. 25.5. Транскрипция и трансляция гена, содержащего интрон. Участки, окружающие интрон, называются экзонами. Гты могут содержать много интро-нов. Белки кодируются только экзонами.
БОТАНИКА
ММА им. И.М. Сеченова
Д. Тейлор, Н. Грин, У. Стаут. БИОЛОГИЯ, т. 3
222 Глава 25
ков ДНК, называемых нитронами, которые не кодируют аминокислотную последовательность белка. Функция интронов до сих пор не ясна. Известно лишь, что если эукариотический ген, содержащий интроны, поместить в бактерию, то бактерия синтезирует бесполезный белок, поскольку у бактерий нет ферментов для удаления интронов из мPHК. Как интроны удаляются из мРНК, показано на рис. 25.5.
Короткие фрагменты ДНК (8-12 пар оснований), используемые для получения липких концов (линкерная ДНК)
Чужеродная ДНК
25.1.3. Этап 2. Встраивание генов в вектор
Как уже объяснялось выше, в качестве векторов чаще всего используют плазмидную ДНК или фаговую ДНК. Сначала рассмотрим схему встраивания в плазмидную ДНК. В принципе та же процедура применяется и в случае фаговой ДНК.
Плазмидная ДНК
Кольцевые молекулы плазм ид ной ДНК у бактерий гораздо меньше, чем основная хромосомная ДНК, поэтому их можно легко отделить друг от друга. Бактериальные клетки разрушают и центрифугируют. При этом хромосомная ДНК оказывается в осадке, а плазмидная ДНК остается в жидкой фазе над осадком. Перед обработкой рестриктазами плазмидную ДНК очищают (рис. 25.1).
