Биосенсоры: основы и приложения - Тёрнер Э.
Скачать (прямая ссылка):
преобразователе. Вещество, образуемое в ходе ферментативной реакции,
следовало бы называть "трансформатом". Тогда анализируемое вещество
(субстрат) превращалось бы в "трансформат" в ферментном слое в среде либо
"католита", либо "анолита".
Если обратить полярность классического амперометрического кислородного
электрода и превратить его в анод с положительным потенциалом около 0,6
В, то он становится совершенно нечувствителен к кислороду, но зато дает
отклик на пероксид водорода, который окисляется до воды. На платиновом
аноде окисляется также аскорбиновая кислота, однако лишь немногие другие
вещества присутствуют в физиологических жидкостях в количествах,
достаточных чтобы влиять на ток в области, соответствующей катодному току
кислородного электрода. Чувствительность этого анода к пероксиду водорода
казалась привлекательной, но поскольку каталаза имеется почти всюду,
биосенсор для определения пероксида водорода не представляет особой
ценности, за исключением случаев измерения активности каталазы или
пероксидазы. Поэтому считалось, что белки только загрязняют поверхность
платины. Так, первое в моей практике использование платинового катода
было связано с настоятельной необходимостью удержать белки и клетки крови
вдали от поверхности платины. Думаю, что размышления о том, как уберечь
платиновый анод от каталазы, и привели меня к идее использовать одну и ту
же мембрану для того, чтобы одновременно удерживать каталазу вдали, а
другие ферменты (все они представляют собой белки с большими молекулами)
вблизи платины. В первом ферментном электроде фермент помещался, как
начинка сандвича, между двумя мембранами, поскольку все еще опасались
загрязнения поверхности платины белками и коферментами. Но я также
добавлял фермент непосредственно в электролит между анодом и катодом, и
электрод хорошо работал при определении глюкозы.
К 1963 г. я занимался прежде всего использованием анодной полярографии
для определения Н202, образующегося в реакции, катализируемой
оксиредуктазой кислорода. При помощи пероксидного сенсора можно
анализировать цельную кровь, что исключает необходимость
центрифугирования и позволяет непрерывно контролировать содержание
субстратов, например определять глюкозу in vivo или в потоке in vitro.
При использовании кислородных электродов необходимо удалять эритроциты
вместе с переносчиками кислорода-гемоглобином и использовать только
сыворотку или плазму крови.
В 1965 г. или около того я определял глюкозу в разбавленной крови
послеоперационных пациентов, опуская электрод в химический стакан. Тогда
лактат все еще определяли по методу Баркера - Саммерсона, и я надеялся,
что однажды будет найдена лактатоксидаза, генерирующая пероксид. К 1965
г. относится мой патент [4], включающий случаи использования одного или
нескольких ферментов для превращения различных субстратов в конечном
итоге в пероксид водорода. В нем также было описано применение двух
электродов, что позволяет вычитать ток электрода без фермента из тока
электрода с ферментом и тем самым исключить фоновые токи. К 1969 г. я
убедил фирму Yellow Springs Instrument Company начать разработку
специального анализатора для прямого определения глюкозы в пробах цельной
крови объемом 25 мкл. И в 1974 г. такой анализатор (модель 23 YSI) после
нескольких неудачных попыток появился на рынке.
Следует иметь в виду, что как используемый фермент, так и поляризуемый
электрод сами генерируют продукты (если угодно, побочные продукты),
которые не обязательно нужны и которые могут мешать протеканию основной
реакции. Так, при окислении
16
Глава I
фенола на поверхности электрода образуется блестящий черный осадок,
который изменяет ее химическую активность и может даже образовать слой,
не проводящий электричество. Важно также, чтобы побочные продукты не
влияли на активность фермента. Лучше всего, когда продукты реакции
растворимы в воде и могут диффундировать из реакционной зоны. В случае
анода на основе глюкооксидазы продуктами реакции являются пероксид
водорода, глюконолактон, глюконат, вода и кислород. Все они хорошо
растворимы и обладают диффузионной подвижностью.
Один из способов решения проблемы полярографически активных веществ,
содержащихся в анализируемом образце, заключается в конструировании
мембран, которые предотвращают попадание нежелательных веществ на
поверхность платины. Для этого необходимо две мембраны, одна из которых,
внутренняя, исключает проникновение любого нежелательного вещества, а
другая - внешняя, обеспечивает прохождение субстрата (а также обычно и
мешающего вещества) в ферментный слой. Разработано множество комбинаций
таких мембран и несколько из них имеется в продаже. Например, в глюкозном
и лактатном электродах фирмы YSI используются комбинации
ацетилцеллюлозных и поликарбонатных мембран Nuclepore.
Переход в полярографии от первых двухэлектродных систем к
трехэлектродной, импульсной, дифференциальной импульсной и т.д.
