Биосенсоры: основы и приложения - Тёрнер Э.
Скачать (прямая ссылка):
46. Wingard L. B., Castner J. F., Yao S. J., Wolfson S. K.. Drash A. L"
Liu С. C. Immobilised glucose oxidase in the potentiometric detection of
glucose. Appl. Biochem. Biotechnol., 9, 95-104 (1984).
47. Wisdom R. A., Dunnill P., Lilly M. D.. McCrae A. Enzyme
interesterification of fats: factors influencing the choice of support
for immobilised lipase. Enzym. Microbiol. Technol., 6, 443-6 (1984).
48. Wong S. S., Malorie T.E., Lee Т.К. Use of Concanavalin A as a
Topographical Probe for Protein-Protein interaction. Lactose Synthase.
Biochim. Biophys. Acta, 745, 90-6 (1983).
Глава 7 Генная инженерия
II. Дж. Уорнер
7.1. Введение
Предметом обсуждения в этой главе будет то воздействие, которое
генетические методы, по-видимому, оказали на сенсорную технологию. В
семидесятых годах, т. е. в течение последних десяти лет, в генетике было
сделано четыре революционных открытия: рестрикция ДНК эндонуклеазами,
обнаружение плазмид (первоначально в бактериях), гибридизация нуклеиновых
кислот, методы определения нуклеотидной последовательности ДНК. Благодаря
этим открытиям стало возможным трансфеци-ровать в различные организмы,
обычно бактериальные клетки, гены разного происхождения и затем
экспрессировать их. Современное состояние техники получения
рекомбинантных ДНК кратко описано ниже.
Можно ли применять эту технику для создания биосенсоров? Цель этой главы
как раз и состоит в том, чтобы ответить на этот вопрос, иллюстрируя это
соответствующими примерами.
С помощью рекомбинантной техники можно улучшить биологические компоненты
биосенсоров на основе ферментов и цельных клеток. При этом не только
улучшатся аналитические характеристики биосенсоров, например путем
оптимизации входящих в них ферментов, но и расширится область их
применения. Описываемая техника поможет также в создании более доступных
источников ферментов, которые в настоящее время трудно получать в
достаточном количестве, что позволит снизить стоимость биосенсоров.
7.2. Техника получения рекомбинантных ДНК
Детальное рассмотрение методов генной инженерии выходит за рамки этой
книги, и здесь они рассмотрены лишь вкратце. Полное представление об этих
методах читатель может получить из превосходной монографии [14].
7.2.1. Молекулярное клонирование
На рис. 7.1 приведена схема типичного эксперимента по клонированию
молекул ДНК. Первый этап-это выделение в чистом виде нуклеиновой кислоты,
кодирующей представляющую интерес функцию, из ее природного хозяина. Из
бактерий и других прокариотов необходимую ДНК часто можно выделить
непосредственно. Для высших растений и животных процедура выделения
несколько отлична, поскольку их ДНК включает последовательности,
известные как интроны. Интроны представляют собой имеющиеся в генах
нуклеотидные последовательности, исключаемые из матричной РНК ( этот
процесс называют сплайсингом) в промежутке между транскрипцией и
трансляцией (рис. 7.2). Чтобы интересующий нас ген мог быть
экспрессирован в прокариотах, интроны необходимо исключить (рис. 7.3). С
этой целью сначала
90
Глава 7
Хромосомы
Клонирующий
вектор
Выделение
вектора
Выделение хромосомы (,разрезание рестрикционным ферментом)
f
Разрезание (рестрикционный фермент)
Сшивание вектора и Фрагментов хромосомы В
Переход в бактериальную клетку
Бактерия с рекомбинантной плазмидой Рис. 7.1. Пример клонирования ДНК,
показывающий роль клонирующего вектора.
I 'еипая инженерия
91
Рис. 7.2. Перенос генетической информации в прокариотах (а) и эукариотах
(б). В первом случае ДНК транскрибируется в матричную РНК (мРНК), которая
затем транслируется с образованием белка. В эукариотах гены содержат
прерывающие последовательности (интроны), которые точно транскрибируются.
Части самих генов называют экзонами. Перед транскрипцией интроны
удаляются из мРНК. Поэтому при клонировании ДНК непосредственно в
прокариотах интроны не распознаются и остаются в мРНК при трансляции, не
позволяя получить активный белок. Эта проблема решается с помощью
методики, иллюстрируемой рис. 7.3.
а
1. Прокариотическая хромосома.
Ген
Транскрипция
2. мРНК
Транскрипт
гена
Трансляция
Белок
1. Эукариотическая хромосома
Ген
Интрон Ген
Нитрон
2. мРНК
Транскрипт
гена
|Транскрипция
3. м PH К после сплайсинга
Интрон Тринскрипт Интрон . гена
I Сплайсинг
Транскрипт
гена
Трансляц ия
Белок
выделяют матричную РНК (мРНК), используя клетки, в которых, вероятно,
имеется ген, представляющий интерес для индукции. В таких клетках
количество изучаемой мРНК составляет существенную долю от всего
имеющегося количества РНК. Из эукариотов матричную РНК выделить довольно
легко, поскольку, в отличие от других типов РНК, ее концевые части
состоят из полиадениновых (полиА) цепей, которые связываются с
политимином (полиТ) в соответствующей аффинной колонке. Изолированную
мРНК подвергают обратной транскрипции in vitro, используя вирусный
фермент обратную транскриптазу. В результате получается так называемая
