Биосенсоры: основы и приложения - Тёрнер Э.
Скачать (прямая ссылка):
Выход обычно измеряют, подсчитывая импульсы аликвоты раствора
сцинтилляционным счетчиком. Затем двухцепочечный зонд кипятят в течение 5
мин, чтобы превратить его в одноцепочечный, и быстро охлаждают или
замораживают, если он не требуется немедленно для гибридизации.
5.2.2.2. Метод гексануклеотидных праймеров. Недавно был разработан
альтернативный метод мечения фрагментов ДНК с высокой специфической
активностью, заключающийся в использовании определенного гексануклеотида,
играющего роль праймера [8]. Преимуществом этого по сравнению с ник-
трансляцией является то, что после гель-электрофореза не требуется
отделять полученные фрагменты ДНК от геля. Плазменный зонд расщепляют на
фрагменты заданной длины и затем подвергают электрофорезу в агарозном
геле с низкой температурой плавления. Фрагменты ДНК визиализируют, как
обычно, окрашиванием бромистым этидием, гель разрезают и его части,
содержащие нужные фрагменты, кипятят в течение 5 мин, чтобы расплавить
гель и получить одноцепочечные фрагменты. Далее добавляют смесь
гексануклеотидных праймеров с [а-32Р] dCTP (300 Ки/моль), охлажденными
dGTP, dATP, dTTP и фрагментом Кленова ДНК-полимеразы-1. Праймеры
гибридизируются с фрагментом с образованием двухцепочечных шаблонов,
которые затем удлиняются фрагментом Кленова и образуют двухцепочечные
меченые зонды. Последние выделяют так же, как в случае ник-трансляции.
5.2.2.3. Концевое мечение. В этом методе меченные различным образом
олиго-
Диагностика генетических заболеваний человека
69
нуклеотиды с высокой специфической активностью вводят в начальные участки
плазмидных зондов. В одноцепочечные зонды вводят метку 32Р со стороны 5'-
конца путем фосфорилирования с помощью полинуклеотидкиназы в присутствии
[а-32Р] АТР. Меченые олигонуклеотиды отделяют от немеченого зонда и
свободной [а-32Р] АТР либо хроматографически на пластинках с тонким слоем
диэтиламиноэтилцел-люлозы, либо электрофорезом в полиакриламидном геле
[6].
5.2.3. Рестриктазный анализ
Этот метод, предложенный Саузерном в 1975 г., обычно называют блотинг-
методом Саузерна. Существует множество его модификаций и
усовершенствований, и в настоящее время рестриктазный анализ используют
во многих вариантах.
В нашей лаборатории этот метод используют для обнаружения
гемоглобинопатий. Процедура анализа очень подробно описана в работе [19],
и здесь мы изложим ее в общих чертах.
Первым шагом является расщепление геномной ДНК рестрикционной
эндонуклеазой. К настоящему времени обнаружено около 90 рестрикционных
эндонуклеаз. Все они разрезают ДНК по определенным сайтам в нуклеотидной
цепи ДНК, в результате чего получаются фрагменты воспроизводимого
размера. Затем пробу расщепленной ДНК (обычно 5 или 10 мкг) помещают в
лунку в 0,8%-ном агарозном геле и подвергают горизонтальному гель-
электрофорезу. Отрицательно заряженные фрагменты ДНК мигрируют к аноду со
скоростью, соответствующей их размеру, - самые маленькие фрагменты
путешествуют дольше всего. Гель пропитывают раствором бромистого этидия,
при этом фрагменты ДНК становятся видимыми и их можно сфотографировать в
ультрафиолетовом свете. Затем, чтобы получить одноцепочечные фрагменты
ДНК, гель пропитывают щелочью. После нейтрализации в сильном буферном
растворе гель приводят в контакт с нитроцеллюлозным или найлоновым
фильтром, чтобы перенести на последний фрагменты ДНК. При этом фильтр
кладут на гель и покрывают сухой бумажной салфеткой, на которую переходят
фрагменты ДНК из геля * в том же порядке, в каком они мигрировали в геле.
Фрагменты фиксируют на фильтре, высушивая его (если использовали
нитроцеллюлозный фильтр), после чего фильтр (с пятнами Саузерна) готов к
гибридизации с содержащим радиоактивную метку ДНК-зондом.
Реакцию гибридизации обычно проводят в полиэтиленовом пакете, поместив
фильтр между двумя листами толстого полиэтилена, края которых сваривают с
трех сторон. Четвертую сторону сваривают после добавления нескольких
миллилитров буферного раствора для предварительной пропитки фильтра.
Далее фильтр инкубируют при температуре гибридизации в течение короткого
периода, что необходимо для сведения фоновой гибридизации к минимуму.
После предварительной пропитки буфер выжимают из пакета, добавляют в него
1 -2 мл буферного раствора для гибридизации и одноцепочечный зонд с
меткой 32Р и пакет снова герметизируют. По завершении реакции
гибридизации фильтр извлекают из пакета и промывают в жестких условиях
(0,1 х SSC, 0,1% SDS при 65° С), чтобы удалить весь негибридизованный
зонд. Наконец, фильтр подвергают авторадиографии, чтобы локализовать
комплементарные фрагменты ДНК, которые гибридизировались с зондом. На
проявленной рентгеновской пленке они выглядят как темные полосы. С
помощью маркерных фрагментов ДНК известного молекулярного веса размеры
гиб-ридизующихся фрагментов можно оценить по расстоянию, которое они
проходят в агарозном геле.
* Английское "blot" означает промокать, отсюда и название блотинг-
