Биосенсоры: основы и приложения - Тёрнер Э.
Скачать (прямая ссылка):
антитела детектировали по флуоресценции, возбуждаемой затухающей волной.
При добавлении свободного гаптена в раствор скорость связывания FITC-
антител с поверхностью уменьшалась в зависимости от концентрации гаптена.
При регистрации флуоресценции под прямым углом (рис. 33.1,в) предел
обнаружения морфина составлял 0,2 мкмоль/л.
В работе [48] обсуждаемый метод использовали в комбинации с
флуоресцентной корреляционной спектроскопией. На кварцевой пластинке при
помощи адсорбированного альбумина иммобилизовали динитрофенол. Затем
исследовали реакцию связанного с поверхностью гаптена с меченными
родамином одно- и двухвалентными антителами. Один из основных выводов из
этих экспериментов - наличие на поверхности большого количества
неспецифически связанного антитела (им обуславливается до 60% сигнала).
По заключению автора [48], высокий уровень неспецифического связывания не
позволяет непрерывно контролировать кинетику связывания.
Используя FITC в качестве метки, авторы [47] исследовали реакцию между
IgG человека и двумя антисыворотками с целью выявить факторы, с помощью
которых можно было бы устранять неспецифическое связывание в системе
НПВОФ. Предварительные опыты показали, что добавление в буферный раствор
избытка (200-кратного по отношению к антителам) подходящей неиммунной
животной сыворотки снижает неспецифическое связывание FITC-меченного
белка до приемлемого уровня. Вероятно, на поверхности волновода
неиммунная сыворотка конкурирует с белками за неспецифически связывающие
центры и насыщает их. Таким образом, в данной системе имеет
34*
532
Глава 33
-FITC- антитело
V
%
&2 Й
& /
г
1- антиген
нет антигена
Буферный
раствор Кислота
I | ( Буферный,
раствор
I_________________
а 6,
J L
J L
ZOO WO 600 800
Время, с
1000
Антиген Антитело '
'/¦ j--------------
\ Y \ Y
Л* к и*, }* Ч* J* ~f* л"
¦к
VV Y V Y
Ч* -<*
\*к к Y* Ч t-y'Y V Y
>*_л* -*/*
Ч\ yV Y
Y Y Y Y Y
Фаза
раствора
Глубина проникновения затухающей волны
Поверхность
волновода
- FITC-антитело
Рис. 33.9. Кривые связывания и схема двухсайтного иммунофлу-оресцентного
анализа с использованием НПВОФ. Поверхность ЭВО покрывают антителами к
IgG человека и приводят в контакт со стандартным раствором IgG
концентрацией 10 мг/мл. Иммобилизованные таким способом антигены затем
реагируют с FI ТС-меченными анти-IgG. Реакцию контролируют, измеряя
интенсивность флуоресценции либо под прямым углом [47], либо по ходу
отраженного луча [46]. а: подготовленный к работе ЭВО; б: сигнал,
генерируемый несвязанным FITC-анти-IgG в области проникновения затухающей
волны (т.е. в слое толщиной dp); в: кривые связывания ПТС-анти-IgG в
присутствии (сплошная линия) и в отсутствие (штрихпунктир) антигена; г:
после промывки несвязанные компоненты удаляются и остаются сигналы
специфически (сплошная линия) и неспецифически связанного (штрихпунктир)
ПТС-анти-IgG: д: разрушение иммунохимических комплексов разбавленной
кислотой.
место конкурентное ингибирование неспецифического взаимодействия между
белками с флуоресцирующей меткой и иммобилизованными антителами.
В буферных системах, содержащих животные сыворотки, проводили также
опыты, целью которых отчасти была оптимизация иммунофлуориметрического
метода определения IgG. На поверхности волновода ковалентно
иммобилизовали анти-IgG овцы, которые затем реагировали со стандартным
раствором IgG человека. Чтобы удалить несвязанные иммуног лобулины,
поверхность промывали буферным раствором. Затем с помощью НПВОФ (с
регистрацией под прямым углом) контролировали реакцию между
иммунохимически иммобилизованными IgG и вторым (FITC-меченным) антителом
кролика. На рис. 33.9 приведен вид сигнала, генерируемого при
использовании
Спектроскопия внутреннего отражения
533
Рис. 33.10. Сдвиг резонансного угла во времени при трех различных
концентрациях анти-IgG; концентрация IgG 2 (1), 20 (2) и 200 мкг/мл (3).
Сдвиг измеряли по увеличению интенсивности отраженного света. На врезке
показана схема связывания антител.
10 15 ZO Z5
Время, с
данной методики, и интерпретация различных его участков. Предел
обнаружения в этой системе приблизительно 5 мкг/мл.
Рассмотренные системы НПВОФ базируются на детектировании флуоресцентного
сигнала под прямым углом. Можно использовать и детектирование по ходу
отраженного пучка (рис. 33.1,г). Для детектирования сигнала в этом режиме
в работах [8, 46] использовали как кварцевые пластинки, так и кварцевые
оптические волокна. Для иммунофлуоресцентного анализа по двухцентровой
реакции предел обнаружения IgG после десятиминутной инкубации с FITC-
антителами достигает 3,0 и 1,5 мкг/мл для плоских и волоконных волноводов
соответственно.
33.4.3. Поверхностный плазменный резонанс
Авторы [37] первыми предложили использовать ППР в качестве способа
контроля иммунохимических реакций и малых изменений толщины
иммунохимических слоев (примерно 30 А). В одной из последних работ в
данной области в качестве модельной реакции исследовали взаимодействие
