Биосенсоры: основы и приложения - Тёрнер Э.
Скачать (прямая ссылка):
глюкозного сенсора, в котором аналог анализируемого вещества, т.е.
декстран, иммобилизован, а биорецептор, т.е. Соп А, несет флуоресцентную
метку и подвижен.
В этом биосенсоре рецепторный белок иммобилизуют на внутренней
поверхности полого диализного волокна, образующего измерительную камеру
преобразователя. Эту конструкцию успешно использовали при разработке
глюкозного сенсора [14, 19]. Специфическим рецептором для сахаров служил
конканавалин А (Соп А), а высокомолекулярный (мол. масса 70 ООО) меченный
флуоресцеином декстран (FlTC-декстран) использовали как аналог
определяемого вещества. Соп А ковалентно иммобилизовали в полой
целлюлозной трубке вне поля зрения оптического волокна [22].
В отсутствие сахара наблюдаемый сигнал сенсора эквивалентен ~ 20%
максимума флуоресценции. В результате множества опытов установлено [13],
что базовый сигнал сенсора примерно на три четверти обуславливается
свободным FlTC-декстраном и на четверть-декстраном, связанным с Соп А на
поверхности диализной трубки. При помещении сенсора в растворы с
повышающейся концентрацией сахара все большее количество декстрана
вытесняется со стенки в поле зрения оптического волокна. Постепенно при
высоких концентрациях сахара весь декстран становится свободным, и
дальнейшего увеличения флуоресценции не наблюдается. Приведенные на рис.
32.5 градуировочные кривые с насыщением типичны для систем, включающих
связывание с рецептором. Упрощенные математические модели, описывающие
такие системы, будут обсуждаться ниже.
Судя по градуировочным кривым для трех различных сахаров (рис. 32.5),
чувствительность рассматриваемого сенсора зависит от константы связывания
определяемого вещества с рецептором. Чувствительность данного сенсора к
метилманиозиду более чем в десять раз превышает его чувствительность к
глюкозе, причем средний уровень
510
Глава 32
Рис. 32.5. Типичные градуировочные кривые глюкозного сенсора на основе
Соп А [13].
Концентрация сахара, анг/лнт
сигнала для производного маннозы соответствует концентрации последнего
примерно 100 мкг/мл. Эти кривые показывают также, что если раствор
содержит смесь сахаров, то выходной сигнал сенсора находится на уровне
средневзвешенного из сигналов присутствующих в системе сахаров. К
счастью, при использовании сенсора для контроля глюкозы в крови другие
сахара, конкурирующие с глюкозой за места связывания, отсутствуют.
Предельная чувствительность этого прибора определяется наименьшей
концентрацией флуоресцеина, которую можно определить. Она составляет
около 100 нг флуоресцеина/мл.
Следует отметить, что фактически такие же характеристики получились бы и
в том случае, если бы Соп А содержал метку флуоресцеина, а декстран
(помеченный)- был иммобилизован на внутренней поверхности диализной
трубки. Схема, изображенная на рис. 32.4,6, имела бы некоторые
преимущества, если было бы легче вводить метку в Соп А, чем в декстран,
или если бы плотность иммобилизованного декстрана была выше плотности
иммобилизованного Соп А.
Вместо мониторинга свободных флуоресцирующих частиц можно было бы также
измерять долю иммобилизованных флуоресцирующих частиц. Для этого
существует ряд оптических методов, но наиболее изящным из них, возможно,
является метод, предложенный в работе [7]. Рецептор закрепляется на
участке сердцевины оптического волокна, очищенном от оболочки, как
показано на рис. 32.6. Затухающая волна проникает в окружающую жидкость
на глубину лишь около 100 А. Таким образом, контролируется прежде всего
абсорбционный слой, состоящий из молекул рецептора и связанного с ними
определяемого вещества. Осуществимость такой схемы продемонстрирована в
работе [1].
Чувствительность рассматриваемых методов можно повысить, используя
флуори-метрию с временным разрешением [25]. При этом подбирают
флуоресцирующие частицы с относительно большим временем жизни после
возбуждения (микросекунды, а не наносекунды, как в случае флуоресцеина).
Это позволяет измерять интенсивность флуоресценции после выключения
возбуждающего пучка света. Преимущество этого подхода состоит в том, что
исключаются помехи, связанные с фоновым рассеянием возбуждающего пучка и
фоновой флуоресценцией примесей (обычно короткоживущих).
Типичными флуорофорами, обладающими подходящими свойствами для флуори-
метрии временного разрешения, являются хелаты редкоземельных элементов.
Так, в работе [11] показано, что "бифункциональные" хелатирующие агенты,
используемые для ковалентного связывания хелатов тяжелых металлов с
альбумином, позволяют
Волоконно-оптические биосеисоры
Рис. 32.6. Конфигурация биосенсора, в котором для детектирования
иммобилизованных комплексов аналога определяемого вещества с
биорецептором используется затухающая волна.
Оболочка.
Определяемое вещество
Т
I Сердцевина I оптического волокна
А * .
Иммобилизованный на поверхности сердцевины биорецептор
Зона
затухания
волны
Пористая
мембрана
проводить определения на уровне микромолей. Для этой цели разработан
