Биосенсоры: основы и приложения - Тёрнер Э.
Скачать (прямая ссылка):
гидролитические реакции, катализируемые растворимым ферментом, проводят
отдельно от концентрационных измерений, выполняемых амперометрическим
оксидаз-ным электродом.
18.2.2.1. Холестерин. Сегодня все озабочены проблемой холестерина,
поскольку существует явная связь между его концентрацией в плазме крови и
сердечно-сосудистыми заболеваниями: с увеличением содержания холестерина
число сердечных приступов возрастает [32]. Для "нормального" мужчины или
женщины среднего возраста содержание холестерина в плазме в среднем
составляет 3,1-6,7 ммоль/л, причем 70% всего холестерина существует в
виде эфиров жирных кислот.
В разработанных несколькими группами исследователей [4, 37, 57]
ферментных электродах для определения свободного холестерина использовали
холестериноксида-зу (COD, ЕС 1.1.3.6), иммобилизованную на поверхности
коллагеновой мембраны или на найлоновой сетке. Концентрацию свободного
холестерина определяли с погрешностью 5-25%. Для определения общей
концентрации холестерина сыворотку выдерживают в растворе Тритон Х-100
или дезоксихолатсодержащих растворах с добавкой гидролазы эфиров
холестерина (СЕН, ЕС 3.1.1.13). Ту же реакционную схему используют в
липидном анализаторе ICA-LG 400 фирмы Toyo Jozo (Япония). Для получения
свободного холестерина пробу сыворотки (30 мкл) предварительно
обрабатывают 7,5 мкл раствора СЕН в течение 11 мин при 37 °С.
Концентрацию холестерина находят с помощью COD, иммобилизованной на
кислородном электроде. Быстрый отклик электрода (всего 15 с) обусловлен
использованием скоростного метода измерения расхода кислорода. В
получаемую величину вносят поправку на сигнал кислородного датчика без
фермента. Одновременно с холестерином определяют также концентрацию
триглицеридов и фосфолипидов (см. ниже). Производительность анализатора-
40 проб в час. Аскорбиновая кислота и билирубин не мешают определению.
Уравнение корреляции с данными неспецифического стандартного метода
анализа для общего содержания холестерина имеет вид у = 1,03.x- - 0,15
ммоль/л; г = 0,985 (и = 50).
В работе [78] описан ферментный электрод, COD и СЕН в котором
непосредственно контактируют/будучи иммобилизованы на поверхности
сферических частиц. Этот электрод позволяет определять с одинаковой
чувствительностью как свободный холестерин, так и его сложные эфиры (рис.
18.6), что свидетельствует о полном гидролизе эфиров. При использовании
Н202-электрода, работающего в стационарном режиме, определение общего
содержания холестерина в пробе сыворотки объемом 50 мкл занимает 5 мин.
Этот двухферментный сенсор, однако, стабилен всего лишь в течение дня.
18.2.2.2. Триглицериды. Анализ на сывороточные триглицериды является
решающим тестом при диагностике и классификации гиперлипидемии.
Гиперлипидемия, известная прежде всего как фактор риска сердечно-
сосудистых заболеваний, ассоциируется и с многими другими болезнями.
Нормальная концентрация триглицеридов в сыворотке крови составляет 0,35-
1,7 ммоль/л.
При определении триглицеридов их прежде всего подвергают каталитическому
г
Применение амперометрических биосенсоров в анализе 273
Рис. 18.6. Градуировочный график для определения общего содержания
холестерина __
в водных стандартных раст-ворах ( •) и растворах сыворотки (х) при помощи
СЕН/ COD-электрода.
50
•-7
30
10
о 50 100 150
Холестерин, лтлголь/л
расщеплению микробной липопротеинлипазой (ЕС 3.1.1.3). При этом
образуется глицерин и жирные кислоты. В последующих реакциях глицерин
превращается в легко детектируемое вещество. При амперометрическом
определении триглицеридов используют растворимую или иммобилизованную
глицериндегидрогеназу (ЕС 1.1.1.6), сопряженную с катализируемым
диафоразой превращением NADH [22, 27]. С другой стороны, в анализаторе
липидов ICA-LG 400 (фирмы Toyo Jozo, Япония) используют глицеринкиназу
(ЕС 2.7.1.30) и глицерофосфатоксидазу (ЕС 1.1.3.-), оценивая скорость
потребления кислорода так же, как при определении холестерина. За один
час можно проанализировать 40 проб сыворотки. Возможность использования
глицериноксидазы привела бы к существенному упрощению этой реакционной
системы.
18.2.2.3. Фосфолипиды. Нормальная концентрация фосфолипидов в плазме
крови лежит в диапазоне от 2,5 до 3,0 ммоль/л. Основным компонентом
является фосфати-дилхолин. При ферментативном определении фосфолипидов
используют комбинацию фосфолипазы D (ЕС 3.1.4.4) и холиноксидазы (ЕС
1.1.99.1). В анализаторе ICA-LGA 400 фирмы Toyo Jozo пробу сыворотки
предварительно обрабатывают растворимой фосфолипазой D и затем с помощью
амперометрического оксидазного электрода находят концентрацию свободного
холина.
В работе [21] пероксид водорода, образуемый в ферментном реакторе,
определяют электрохимически с помощью ферментов, соиммобилизованных в
гидрофобном агарозном геле. Время отклика прибора с проточным ферментным
реактором составляет 2 мин, а диапазон линейности отклика-от 0 до 4
ммоль/л.
18.2.3. Высокомолекулярные растворимые вещества
