Биосенсоры: основы и приложения - Тёрнер Э.
Скачать (прямая ссылка):
полиакриламидного, карагенанового и т.п. или фотополимеризующегося
поперечносшитого полимера, к которому для повышения гидрофобности могут
пришиваться различные группы [22]. Мягкие условия изготовления электрода
позволяют тщательно контролировать количество биомассы. Несмотря на то,
что время пропитывания электрода исследуемым раствором, содержащим
субстрат, должно быть порядка нескольких секунд, могут возникнуть
ограничения, связанные с массопереносом. С другой стороны, это может
стать преимуществом, поскольку при разумном выборе физических
характеристик системы можно предотвратить проникновение загрязняющих
веществ в анолит или
250 I лива I?
регулировать подвижность медиатора и его окислительно-восстановительные
свойства.
17.5.3.3. Ковалентное связывание. Методы ковалентного связывания,
используемые для ферментов, могут быть адаптированы и для целых клеток
[57]. Плотный клеточный слой прочно удерживается на поверхности, что
позволяет избежать проблем, связанных с диффузией. Лучшие из применяемых
методов включают двухстадийный процесс, в котором сначала поверхностные
группы, например карбоксилатные, активируют, используя карбодиимид как
сопрягающий реагент, а затем образующийся поверхностный полимер реагирует
с микроорганизмами. При этом образуется активный слой, связывающий
большое количество биомассы и обладающий повышенной биологической
устойчивостью. Полученные недавно результаты показывают, что электрод с
закрепленным этим методом монослоем, содержащим 1 мг микроорганизмов
(сухой вес) на 100 см2 (реальной поверхности), дает вполне
удовлетворительный по величине сигнал (ток в миллиамперном диапазоне).
17.5.4. Редоке-медиаторные системы
Первые работы с описанными выше медиаторными топливными элементами и
ферментными электродами пролили свет на различные проблемы, связанные с
ре-докс-медиаторами. Особенно важно было бы идентифицировать или
синтезировать такие медиаторы, которые могут сопрягать биокатализатор с
электродом, избегая при этом потерь активного редокс-компонента во время
измерения (хотя в приборах одноразового действия потеря медиатора или
других компонентов вполне допустима). В датчиках для длительного
использования, у которых сигнал может зависеть от концентрации медиатора
и потеря его приводит к плохой воспроизводимости, концентрацию медиатора
можно поддерживать постоянной при помощи контролируемого высвобождения из
микрокапсул [33, 54]. Альтернативой является поиск медиаторов или их
производных, размеры молекул которых слишком велики, чтобы проникать
через сеть субстрат-проницаемого геля или какой-либо другой структуры,
обеспечивающей иммобилизацию микроорганизмов. Ионные медиаторы могут
удерживаться также противоположно заряженным полимером или компонентом
сополимера, соответствующим образом локализованным или распределенным в
гелевом носителе. Ниже рассмотрены некоторые другие возможные подходы,
используемые в настоящее время.
17.5.4.1. "Заякоренные" медиаторы. В последние годы достигнут
значительный прогресс в синтезе "специальных" полимеров [27], и имеется
множество способов, с помощью которых органические или неорганические
медиаторы можно "заякорить" на полимерных подложках [46] или прикрепить к
клеточным стенкам. Можно представить себе, например, систему (рис. 17.9),
в которой редокс-активный медиатор подвешен на гибкой молекулярной цепи -
"якорной" точке (Р) линейного цепного полимера с открытой структурой. В
такой "маятниковой" конструкции окисленная часть медиатора (Мох) находит
доступ к внутриклеточному источнику электронов, проникая через внешнюю
клеточную стенку (верхняя часть рисунка), затем медиатор в
восстановленной форме (Mred) диффундирует к электроду и вновь окисляется.
Внешние клеточные стенки микроорганизмов исключительно разнообразны по
структуре и составу. Поэтому осуществимость предложенного выше механизма
будет зависеть от того, какой тип микроорганизмов исследуется. В общем
случае грам-отрицательные микроорганизмы устроены более сложно, чем грам-
положительные. Доступ к восстановительным областям облегчен, если
микроорганизм имеет экзоферменты, но становится все труднее в ряду:
периплазматические ферменты - цитоплазматические ферменты-митохондрии в
эукариотических клетках. Многие бактерии
От акт шины \ > т ментов к биосенсорам
Рис. 17.9. Схематическое изображение биокаталитического слоя, содержащего
микроорганизмы: медиатор прикреплен к полимеру гибкой цепью.
имеют стенки толщиной 5-20 нм, состоящие г лавным образом из
пептидогликана, цепочечного дисахаридного гетерополимера гликана с
пептидными заместителями [26, 53]. Боковая цепь из 10-15 СН2-групп в
принципе позволяет электронам по описанному выше механизму переправляться
через зазор шириной 5-10 нм, что вполне достаточно для медиаторного
переноса заряда из многих микроорганизмов даже в случае "экономного
распределения" медиатора. (Одной частице медиатора на каждые 20 мм2, или
