Проблемы и перспективы молекулярной генетики. Том 1 - Свердлов Е.Д.
ISBN 5-02-002753-7
Скачать (прямая ссылка):
rho0 7 1728 38,2±1,7
srm8 rho+ 6 1956 34,1 ±5,5
rho~ 7 2106 48,7±4,0
srml 2 rho+ 7 3390 6,4±1,7
srml5 rho+ 7 2024 10,1±1,3
rho~ 7 1503 5,8±1.4
srml7 rho+ 8 1938 16,8±0,9
вана невозможность совместного поддержания в клетках S. cerevisiae мтДНК и плазмиды-киллера из Kluyveromyces lactis (Gunge, Yamane. 1984). Сходная ситуация может иметь место и для плазмиды из Z. rouxii. С другой стороны, мутации дыхательной недостаточности могут усиливать экспрессию ядерных генов (Puglisi, Algeri, 1971; Parikh et al., 1987; Kaisho, 1989), в том числе, возможно, и генов, участвующих в поддержании этой плазмиды.
Спонтанно возникшие цитоплазматические мутации petite в большинстве своем являются мутациями rho~, т.е. необратимыми дегенеративными перестройками митохондриального генома. В группах .svw-мутантых трансформантов, упомянутых в предыдущем параграфе, отбирали для анализа спонтанно возникшие мутанты petite, сохранившие плазмиды. Как видно из табл. 2.6, А и Б, у клеток SRM+ дефекты генома митохондрий не сказываются на поддержании изученных плазмид YCp50 и YRp 12. Вместе с тем выявлены по меньшей мере два случая модификации поддержания плазмид у мутантов rho , а именно возникновение r/го--мутаций сопровождалось повышением митотической стабильности обеих плазмид в клетках srm8 и снижением митотической стабильности YRp 12 в клетках srml5 (%2 = 21,2; Р < 0,001).
96
Таким образом, в поддержании дрожжевыми клетками рекомбинантных генетических структур, по-видимому, играют роль ядерно-митохондриаль-ные генетические взаимодействия с участием хотя бы некоторых генов SRM.
3. ГЕНЫ SRM, CHECKPOINT-KOHTPOrb И РАДИОЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ ДРОЖЖЕЙ 3.1. ПРЕДВАРИТЕЛЬНЫЕ ЗАМЕЧАНИЯ
Известно, что генетически обусловленные нарушения поддержания наследственных структур, прежде всего хромосом, часто сопровождаются повышением чувствительности клеток к ДНК-тропным повреждающим агентам. С другой стороны, у нормальных эукариотических клеток, в частности, клеток дрожжей, аномалии, возникающие на протяжении цикла клеточного деления, например повреждения наследственных структур, способны вызывать остановку клеточного цикла. Этот ответ клеток на возникающие внутриклеточные нарушения опосредован множественными генами; предположительно продукты некоторых таких генов сканируют хромосомную ДНК и в случае обнаружения повреждений обеспечивают задержку клеточного деления. Задержка, как полагают, дает клеткам дополнительное время для репарации поврежденной ДНК. В отсутствие задержки в митоз будут вступать клетки с генетическими повреждениями, потомство которых скорее всего окажется дефективным или нежизнеспособным. Механизм обратной связи, обеспечивающий остановку клеточного цикла при нарушении его нормального прохождения и именуемый checkpoint-контролем, обнаружен у Saccharomyces cerevisiae более 15 лет назад (Weinert, Hartwell, 1988). (Одному из авторов открытия, JI. Хартуэллу, в 2001 г. присуждена Нобелевская премия). Последствиями нарушений checkpoint-регуляции клеточного деления в ответ на повреждения ДНК во многих случаях являются снижение точности митотической передачи компонентов наследственного аппарата и повышение чувствительности клеток к летальным эффектам ДНК-тропных агентов (Weinert, Hartwell, 1990). Значительный интерес исследователей к рассматриваемому регуляторному механизму связан, в частности, с широко распространившимся представлением о тесной связи между нарушениями checkpoint-контроля и малигнизацией клеток (Morgan, Kastan, 1997). К настоящему времени идентифицированы некоторые гены дрожжей, играющие ключевую роль в checkpoint-контроле.
Согласно современным представлениям о механизме checkpoint-контро-ля, запускаемого в действие при наличии повреждений в ДНК, гены RAD9, RAD17 и RAD24 действуют на первых этапах узнавания повреждений. Белковый комплекс RFC-Rad24, по-видимому, играет роль в загрузке (loading) комплекса Radl7-Mec3-Ddcl или репарационных ферментов на повреждения ДНК (Longhese et al., 1998). Протеинкиназа Rad53 участвует в киназном каскаде передачи сигнала, а активность другой киназы, Cdc28 [серин-трео-ниновой протеинкиназы p34cdc2/28, играющей центральную роль в регуляции клеточного цикла (Mendenhall, Hodge, 1998)], существенна на завершающих
4. Проблемы и перспективы...
97
этапах механизма обратной связи, котооый задерживает смену фаз клеточного цикла. Протеинкиназа RatL>3 обеспечивает ингибирование киназы Cdc5, необходимой для деградации циклинов - регуляторных субъединиц киназы Cdc28 (Sanchez et al., 1999). Поддерживая таким образом высокую активность протеинкиназы, Cdc28, Rad53 препятствует, например, выходу клеток из митоза и завершению цикла деления, (оба события происходят при инактивации киназы Clb2/Cdc28). Эту задержку событий клеточного цикла, возникающую в ответ на повреждения ДНК, снимают мутации как в гене RAD53, так и в гене CDC28, а также мутации в генах RAD9 и RAD24, нарушающие распознавание повреждений ДНК.
Мутации перечисленных 4 генов, вовлеченных в один общий механизм checkpoint-контроля/определения радиочувствительности клеток, при их фенотипическом проявлении должны, очевидно, маскировать присутствие друг друга (эпистаз). Мутации, полностью инактивирующие гены RAD53 и CDC28, летальны. Поэтому следует ожидать, что мутации rad9A и rad24A, полностью блокирующие функции соответствующих генов, будут эписта-тичны по отношению к нелетальным (leaky) мутациям rad53 и cdc28 (а последние, соответственно, гипостатичны по отношению к rad9A и rad24A). Взаимодействие мутаций rad53 и cdc28, которые у жизнеспособных клеток блокируют функции соответствующих генов не полностью, не обязательно должно носить характер эпистаза, возможен аддитивный или даже синергический эффект. Вместе с тем радиочувствительность двойных мутантов rad53 cdc28 не должна, вероятно, быть выше радиочувствительности клеток с эпистатичной мутацией rad9A или rad24A. Как будет видно из материала, приводимого в следующем параграфе, такие предположения, основанные на современных моделях checkpoint-контроля (Lowndes, Murguia, 2000), в опыте подтверждаются лишь отчасти. Мутации rad9A и rad24A действительно эпи-статичны по отношению к каждой из мутаций cdc28 и rad53. Однако радио-чувствительность двойных мутантов rad53 cdc28 оказывается выше радио-чувствительности мутантов rad9A или rad2 4А. Этот результат указывает (по-видимому, впервые) на существование иного, зависящего от генов CDC28 и RAD53, но /?/Ш9-независимого механизма определения радиочувствительности клеток.
