Проблемы и перспективы молекулярной генетики. Том 1 - Свердлов Е.Д.
ISBN 5-02-002753-7
Скачать (прямая ссылка):
Трансформирующее Терапевтическое
действие на клетки- действие на клетки-
мишени мишени
Рис. 81. Структура разработанных автономных векторов, основанных на использовании ori Р вируса EBV, активируемого вирусным белком EBNA-1 (Krysan et al., 1989)
Family of repeats - модуль ori, взаимодействующий с ядерным матриксом. Dyad - модуль ori, необходимый для инициации репликации. EBNA-1 - ген EBV, кодирующий транс-действующий фактор, активирующий ori, обладающий онкопотенциалом. Гетерологичная кДНК - последовательность вектора, кодирующая белок, обладающий терапевтическим действием в клетках-мишенях, выбранных для генной терапии
R • on Р 53
В SV40
А
В
Время, дни
Г
я
о
о
<D
Он
с
о
со
03
К
*
03
ь
Он
О
С
(D
150
120
90
60
30
30
4
8 10
Время, дни
Рис. 82. Подход к созданию и характеристики экстрахромосомного поддержания безопасного автономного вирусного вектора, основанного на модифицированном трансдействующем вирусном факторе (Cooper et al., 1997)
А - схема полипептидной цепи T-ag с генетическими детерминантами, определяющими его взаимодействие с белками-супрессорами злокачественной трансформации р53, РВ, а также с ori SV40. Б - модификация T-ag с помощью замены двух аминокислотных остатков (107 и 402), приводящая к снижению онкопотенциала за счет потери взаимодействия модифицированного белка с р53 и РВ. В - поддержание рекомбинантных автономно-ренлицирующихся конструкций, основанных на функции ori SV40 и содержащих гены дикого и модифицированного T-ag (транс-действующего фактора ori) в культуре клеток Раджи. Г - уровень репортерного продукта гена LacZ, клонированного в модифицированной автономно-ре-плицирующейся конструкции, регулируемой модифицированным T-ag, по сравнению с вариантом простой плазмидной конструкции
ARS
ARS
j
oc
о
о
>
CU
J' У)
CU Си
3
>
Си
&
о
о
Ш
>
си
С/?
си
&
о
о
щ
1 Т. И. н.
Рис. 84. Формирование стабильного экстрахромосомного трансгена рг8а тутового шелкопряда в результате серии перестроек трансгенов (Николаев и др., 1991, 1993а, б)
А - схема формирования стабильного экстрахромосомного трансгена в результате серии перестроек трансгенов при переносе экзогенной ДНК и при передаче по наследству.
Красная линия - ARS-содержащая область трансгенов и эндогенной экстрахромосомной ДНК. Желтая линия - фрагмент клеточной ДНК шелкопряда Fq-поколсния (желтая линия). Зеленая линия - фрагмент клеточной ДНК шелкопряда Р^поколения (зеленая линия). Черная линия - фрагмент плазмиды pBR322 (черная линия).
Б - физическая карта рг8а с указанием рестрикционных сайтов. Красная линия - ARS-элемент рг8а. Черная линия - фрагмент последовательности pBR322
А
Р Р
ARS
мыши
Б
Р
Рис. 86. Схема перестроек стабильного трансгена шелкопряда после его переноса и передачи по наследству в трансгенных мышах (Николаев и др., 1998)
А - схема последовательных делеций рг8а после переноса ее в зиготу мыши. Del, - обнаружена после переноса рг8а в пронуклеус мышей. Del2 - обнаружена после передачи трансгена по наследству от основателей к мышам Fj-поколения. De^ - обнаружена после передачи трансгена по наследству от мыши Fr поколения к мышам Р2-поколения. Красная линия - ARS мыши. Лиловая линия - фрагмент ARS рг8а, де-летированный на стадии dell, и не требующийся для поддержания автономного статуса трансгенов в мышах. Б - стабильный трансген, обнаруживаемый в мышах Р2-поколения, являющийся образованней in vivo производной рг8а. Выявление этого трансгена в составе суммарной ДНК трансгенных мышей F2-no-коления представлено выше (рис. 85). Размеры плазмид и делеций даны в т. п.н.
Sequence
Рис. 88. Обнаружение в автономных трансгенах участков изогнутой ДНК (Nikolaev et al., неопубликовано)
А - стабильный экстрахромосомный трансген мышей pmyc(H-P) (Sudo et al., 1990), в ARS-элеме лтс которого ранее было экспериментально показано присутствие участка изогнутой ДНК (Trivedi et al., 19с>8). Б - стабильный трансген шелкопряда рг8а (представлена гистограмма части EcoRI—RvuII фрагмента трансгена). Детектирование участков изогнутой ДНК проведено с помощью программы Bcnt-lt, размещенной на сайте: www2,icgeb.trieste.it/dna/bend_it.html, согласно которой участок предположительно изогнутой ДНК должен характеризоваться уменьшенным ГЦ-содержакием и увеличенным свыше 5° углом поворота двойной спирали в расчете на один виток. Зеленая линия - изогнутая ДНК
Д 1 ctgtttttctcaccacatttttttcattattgtttccttcctcttttaccccagagcctt 61 tttagaaacttttttctgattgattctcccattatattttaatcacatatacactgtgta 121 t ct a 111 аса t at cct at gt at at ct ct at t ct at a cat t aa att aaa aa gt ataaaatt 181 aatjsttttattat^^
241 cattttacttaacttgataactatattcttagagcaacttttttgaaaatagatttttgt 301 gggtacataagaggcgtctgtgtttatggaataagtgaaatatttttatataggcagaca
361 attcataataatcacagcagggtgaatggagtatccaatgcttcaaacatttatcatttc
421 t ct ct gctacat acatccca+ ttat act att ttagtt atttt ataat at at aat aaatta 481 t cat taacagtag tcatcctattgagctatcgaatactaaat cat att cat ttt ttctaa 541 ctatattttttgtgcccgttagccatctccattttcccccatatgatccagcaatcccac 601 tactgggtatttatccaaaggaaatgaaatcagtatgtcaacaaaatatttacactccca 661 tgtttattgcagcactattcacaatagctaagatttggaagcaacttaggtgtctaacag 721 at ga at g gat aaa ga aaa t at ggc act t at аса caa t gg agt act act t a gcc at a aaa a 781 agaatgagagatcctgtcatttgcaagaacatggatggagctggaggacattatgtteat 841 tggacaacattaaacccattgatctgcacatacctaaccacacttgaatctctaggacaa 901 attccacttggtcatgatgaatgattgttttaatgtgttctt
