Проблемы и перспективы молекулярной генетики. Том 1 - Свердлов Е.Д.
ISBN 5-02-002753-7
Скачать (прямая ссылка):
R Н
? И
Nc R К i
-Ф-
R Н
|Н
гг
4
нв \ \
*
DT-A PGK-neo
3’
3"
Н R
I ,
PGK-neo
3"
н
5 6 НВ
И
нв
Н
5 6
302
ном использовали кассету с геном субъединицы А дифтерийного токсина (ДТ-А). В работе использовали линию ЭС клеток w9.5, выделенную из линии мышей 129SvJ. Для получения химерных мышей ЭС клетки инъецировали в полость 3,5-дневных бластоцист мышей линии C57BI/6. Далее бластоцисты переносили в рог матки мышей линии BALB/c в сроки псевдобеременности 2,5-3,5 дня. Трансфекцию ЭС клеток проводили методом электропробоя. После электропорации ЭС клеток и последующей селекции было получено около 400 G418 устойчивых клонов ЭС клеток мыши, из которых 130 были заморожены и использованы для выделения ДНК. Среди первых 5 клонов, проанализированных с помощью блот-гибридизации, был обнаружен один клон с таргетированным геном PDGF-A (клон 1).
Следующим этапом работы было получение химерных мышей путем инъекции клеток клона 1. В бластоцисты мыши. В результате пересадки 13 бластоцист родилась одна химерная самка со смешанной пигментированной шерстью черного цвета и цвета агути, что свидетельствует о способности таргетированных ЭС клеток принимать участие в развитии волосяных фолликулов в эмбриогенезе. Подробнее проблема получения трансгенных и химерных животных изложена в статье Л.Е. Андреевой и В.З. Тарантула в настоящей книге.
У гомозиготных мышей с нокаутированным геном PDGF-A наблюдались патологии во многих тканях мезенхимного происхождения (Bostron et al., 1996). При развитии легких эта мутация приводила к эмфиземе и невозможности формирования альвеол. Как и ожидалось, гомозиготные по мутантному гену мыши погибали либо на эмбриональных стадиях, либо сразу после рождения. Эта работа уже дала первую важную информацию о роли PDGF-A. Однако поскольку имеются данные о различном фенотипическом проявлении гомозиготных “нокаутированных” генов в различных линиях мышей (Sibilia, Wagner, 1995), одним из возможных вариантом продолжения этой работы является получение линии мышей, гомозиготной по “нокаутированному” гену PDGF-A с целью более детального анализа функций этого гена.
ЗАКЛЮЧИТЕЛЬНАЯ ЧАСТЬ
В последнее время все большее внимание исследователей направлено на возможность клонирования млекопитающих путем переноса ядер в энукле-ированные ооциты. Преимущество этого метода заключается в том, что все клетки в потомстве, включая зародышевые, представлены генотипом ЭС клеток. ЭС клетки сельскохозяйственных животных могут служить источником тотипотентных ядер, которые могут быть использованы в качестве доноров для пересадки ядер с целью получения генетически идентичных трансгенных животных причем практически в неограниченном количестве (Bondioli et al., 1990, Stice, Robl, 1989, Campbell et al, 1995). Широкие перспективы открываются в плане возможного использования эмбриональных стволовых и стволовых клеток для клеточной терапии различных тяжелых заболеваний человека, таких как, например, диабет, онкологические и ней-родегенеративные заболевания. Необходимым для достижения этой цели условием является получение in vitro как можно более “гомогенных” (по ти-
303
пу клеток) клеточных культур. В связи с этим чрезвычайно важным является поиск факторов как белковой так и небелковой природы, способных регулировать процессы дифференцировки этих клеток в определенном направлении. Таким образом, комплексные исследования соматических клеток млекопитающих и человека, включая эмбриональные стволовые клетки, открывают широкие возможности как для продолжения исследований фундаментальных молекулярно-генетических процессов, лежащих в основе жизнедеятельности этих клеток, так и для практической медицины XXI в.
ЛИТЕРАТУРА
Гордеева О.Ф., Мануйлова Е.С., Гуляев Д.В., Гривенников И.А. Дифференцировка эмбриональных стволовых клеток в культуре. Морфологические аспекты. Цитология.
2001. Т. 43, №9. С. 851.
Дыбан А.П. II Раннее развитие млекопитающих. JL: Наука, 1988. С. 34-49.
Лойда 3., Госсрау Р., Шиблер Т. // Гистохимия ферментов: Лабораторные методы. М.: Мир, 1982. С. 64—67.
Макарова И.В., Незнанов Н.С., Цымбалюк Е.С. и др. Таргетинг гена A-цепи тромбоци-тарного фактора роста (PDGF) и получение химерной мыши с “нокаутированным” геном // Молекуляр. генетика микробиология и вирусология. 1997. Т. 4 С. 23-25. Мануйлова Е.С., Гордеева О.Ф Гривенников И.А., Озернюк Н.Д. Эмбриональные стволовые клетки; спонтанная и направленная дифференцировка // Изв. РАН. 2001. Т. 6. С. 704-710.
Межевикина Л.М., Мануйлова Е.С.. Попов В.И., Савченкова И.П. Физико-химические аспекты роста и дифференцировки эмбриональных стволовых клеток в условиях культуры. Консервация генетических ресурсов. Пущино, 1998. С. 182-186. Межевикина Л.М., Смирнов С.В. Смолихина Т.П. и др. Плюрипотентность и генетическое разнообразие эмбриональных стволовых клеток линии D3 в зависимости от условий культивирования // Цитология. 2001. № 4. С. 363.
Миталипов Ш.М., Миталипова М.М., Иванов В.И. Влияние длительности культивирования на плюрипотентность эмбриональных стволовых клеток in vitro и in vivo // Онтогенез. 1994. Т. 25. С. 19-27.
