Проблемы и перспективы молекулярной генетики. Том 1 - Свердлов Е.Д.
ISBN 5-02-002753-7
Скачать (прямая ссылка):
В другом эксперименте в качестве ARS-элемента гибридной конструкции была использована последовательность из состава сложного хромосомного ori, локализованного в локусе гена с-тус (рис. 79, А). Было обнаружено, что данная конструкция, после ее переноса в ядро клеток полового пути мышей (рис. 79, Б), поддерживалась в клетках хвоста мышей в течение нескольких поколений в качестве стабильного экстрахромосомного генетического элемента, передаваемого из поколения в поколение с нарушением менделевских законов наследования (рис. 79, В) (Sodo et al., 1990). Важный момент данной работы заключался в том, что впервые была продемонстрирована ARS-активность фрагмента ori высших эукариот.
Таким образом, к началу 90-х годов возможность экстрахромосомного поддержания трансгена была неоднократно экспериментально подтверждена, а также был сформулирован принцип создания экстрахромосомных конструкций, заключающийся во внесении ARS-элемента в известный клонирующий вектор. В последующие годы исследования автономной репликации и транскрипции экстрахромосомных трансгенов сконцентрировались главным образом на модели трансфецированных (трансформированных) клеток
219
А
ARS фрагмент гена с-тус
0 ?
1 | 'fc;
1 2 3 4 5 6 7 8 9 Ш ООО оосш ???
2
F0
1 2 • • i -................... .> -1-f-T-1-1 3 4 5 6 7 8 F1 i • • «ни 4-
1 2 Л 4 5 1 2 3 4 5 6 7
OOOOOODDOOOO
1 2 3 4 5 67 8 0 1011 1213 • •• •• шва ?? ? ? ?
Рис. 79. Структура и неменделевское наследование автономного трансгена р//гус(Н-Р) в семействах трансгенных мышей (Sudo et al., 1990)
А - схема переносимой конструкции рту< (\ I-Р); темный участок конструкции: ARS-фрагмент из локуса гена с-тус; неокрашенный участок конструкции: бактериальная последовательность плазмиды p(JC19.
Б - этап переноса ртус(Н-Р) в ядро клеток полового пути мышей с помощью микроинъекции в зиготу. В - неменделевское (100%) наследование конструкции рпгус(Н-Р) по материнской линии: 1 и 2 - основатели, трансгенные по ртус(Н-Р).
Мыши мужского пола (затемненные квадраты — трансгенные мыши, открытые квадраты — мыши без трансгена); мыши женского пола (затемненные кружки - трансгенные мыши, открытые кружки - мыши без трансгена); К - контрольные мыши
млекопитающих. При этом анализ ARS-активности рекомбинантных конструкций, осуществляемый путем наблюдения за экстрахромосомными трансгенами в трансфецированных клетках, превратился в один из методических подходов к изучению строения как ori, так и ARS-элементов высших эукариот (Depamphilis, 1993).
220
ИЗУЧЕНИЕ УЧАСТКОВ ИНИЦИАЦИИ РЕПЛИКАЦИИ - ОСНОВА ДЛЯ КОНСТРУИРОВАНИЯ АВТОНОМНЫХ ТРАНСГЕНОВ
В настоящее время установлено, что инициация репликации ДНК хромосом, а также экстрахромосомной ДНК (эписом) происходит, как правило, в определенных участках ДНК, называемых соответственно ori- и ARS-эле-ментами репликации. Уже пионерные исследования структуры ori высших эукариот показали, что они устроены гораздо сложнее, чем ori прокариот, вирусов и дрожжей S. cerevisiae (Benbow et al., 1992). Инициация репликации в области ori/ARS является многостадийным процессом, включающим координированное взаимодействие десятков ядерных факторов со специфическими сайтами в области ori, а также за его пределами (Coverly, Laskey,
1994).
К настоящему моменту изучено несколько ori высших млекопитающих, к числу которых относятся ori, локализованные в локусе DHFR (Dijkwel. Hamlin, 1992, 1995; Vassilev et al., 1990), в области генов с-тус (рис. 80, a) (Leffak, Janies, 1989; McWhinney, Leffak, 1990), гена Р-глобина (Kitsberg et al., 1993; Aladjem et al., 1995) и гена альдолазы В (Zhao et al., 1994). Важно, что для последних трех ori однозначно показано, что относительно короткие хромосомные фрагменты этих элементов способны поддерживать автономную репликацию содержащих их рекомбинантных плазмид в клеточной культуре, т.е. функционировать так же, как ARS-элементы (рис. 80, А, Б). В целом однозначного соответствия между ARS-активностью и хромосомной репликацией у высших эукариот не имеется, так как фрагменты ori высших эукариот не всегда обладают ARS-активностью даже в одних и тех же типах клеток. Только в дрожжах S. cerevisiae было обнаружено, что ori и ARS этого организма во многом эквивалентны (Umec et al.,
1989). Принимая во внимание сходство принципов структурной организации ori дрожжей и многоклеточных организмов, дрожжи можно рассматривать как одну из возможных хозяйских систем для предварительной характеристики ARS-активности и отработки принципов конструирования автономных векторов.
Очевидно, характеристика новых ARS-элементов и изучение их структуры (в том числе в сопоставлении со структурой хорошо охарактеризованных ARS-элементов) может способствовать изучению различных аспектов регуляции репликации ДНК, а также дать информацию по принципам дизайна автономных конструктов.
В настоящее время известно лишь несколько подробно охарактеризованных ARS высших эукариот (De Pamphilis, 1999). К числу таких элементов относится клонированный нами ARS, находящийся в составе стабильного трансгена шелкопряда рг8а. Этот элемент является первым клонированным ARS шелкопряда, способным, к тому же, к функционированию в других хозяйских системах (Николаев и др., 1993, 1998). Функционирование ARS в нескольких гетерологичных системах является редким событием, имеются лишь отдельные сообщения, фиксирующие примеры такого рода (Ariga et al., 1987; Hayashi et al., 1997). Очевидно, данные такого рода являются значимыми для выяснения влияния особенностей экспрессии генома в разных типах клеток на регуляцию автономной репликации. Сравнительное исследование ARS-активности в нескольких хозяйских системах, в том числе в
