Молекулярная биология. Структура и функция белков - Степанов В.М.
ISBN 5-06-002573-Х
Скачать (прямая ссылка):
одноименными субъединицами. В других случаях удается добиться диссоциации четвертичной структуры в присутствии умеренных концентраций мочевины или солянокислого гуанидина — реагентов, вызывающих расщепление межсубъединичных водородных связей, а также гидрофобных контактов. Довольно хорошие результаты дает исчерпывающая модификация аминогрупп лизина ангидридами дикарбоновых кислот, например янтарным ангидридом:
156
/СО-СНг
-сн2-сн2-*ш2 + О |
^ЧЮ-СНг Лизин Янтарный
ангидрид
В результате такой реакции, затрагивающей практически только е-аминные группы остатков лизина, которые в нормальных условиях полностью протонированы и несут положительный заряд, последние заменяются отрицательно заряженными карбоксилат-ионами сукцино-ильных группировок. Происходит резкое изменение поверхностного заряда белковой Глобулы (в данном случае субъединицы). Появление на контактирующих поверхностях субъединиц одноименных отрицательно заряженных групп резко ослабляет взаимодействие между ними и приводит к диссоциации четвертичной структуры. Определение молекулярной массы диссоциированных субъединиц, как и исходного белка, проводят методом седиментационного анализа или чаще гель-фильтрацией.
. Впрочем, при первичной характеристике белка обычно прибегают к жесткой денатурации молекулы, разрушению в ней всех нековалентных взаимодействий, что вызывает, естественно, и полную утрату четвертичной структуры. Излюбленный прием состоит в обработке белка анионным детергентом — додецилсульфатом натрия. Как уже отмечалось в разд. 6.10, этот детергент прочйо связывается с гидрофобными элементами полипептидной цепи и вызывает ее полное развертывание в палочковидную структуру, заряженную отрицательно, причем количество связавшегося додецилсульфата в расчете на единицу длины полипептидной цепи, а значит, и плотность отрицательного заряда весьма постоянны. Ввиду этого электрофоретическая подвижность таких комплексов зависит только от длины цепи, что дает возможность выяснить, состоит ли изучаемый белок из одного или нескольких видов субъединиц, отличающихся по молекулярной массе. Сравнение же электрофоретических подвижностей субъединиц и набора стандартных белков с известными молекулярными массами позволяет определить и молекулярные массы субъединиц.
Заметим, что проведение электрофореза комплексов 0е/юк — до-децилсульфат в свободном растворе невозможно, так как зоны разделяемых компонентов будут перемешиваться из-за неизбежной конвекции. Чтобы снизить этот эффект, электрофорез проводят в гелях полиакриламида, поперечносшитого метилен-бисакриламидом. Полимерная сетка, плотность которой определяется концентрацией взятого для приготовления геля акриламида и сшивающего компонента, соз-
157
—> —СН2—СН2—NH~4I!0—СН2—СН2—С00“
Сукциноил-лизин
Дает препятствия для перемещения к аноду отрицательно заряженных комплексов тем большие, чем больше длина пептидной цепи. Регулируя плотность геля, можно подобрать оптцмальные условия для определения той или иной величины молекулярной массы. Точность метода вполне удовлетворительна для анализа четвертичной структуры.
Для определения стехиометрии четвертичной структуры требуется знать, из скольких видов субъединиц построен белок и какова их
молекулярная масса. Если при этом известна молекулярная масса
/
нативного белка, можно сделать определенные предположения о его четвертичной структуре. Несколько сложнее обстоит дело при изучении белков, имеющих разные субъединицы одинаковой или очень близкой молекулярной массы. В таких случаях используют определение N-концевых аминокислот или последовательностей, которые могут оказаться характерными для каждой из субъединиц, или же прибегают к поиску способа диссоциации белка на субъединицы, сохранившие третичную структуру, что позволяет разделить их каким-либо из хроматографических методов.
7.5. ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ ЗНАЧЕНИЕ ЧЕТВЕРТИЧНОЙ СТРУКТУРЫ БЕЛКА
Подробный анализ функциональной роли четвертичной структуры может быть дан только на примере конкретных белков, что выходит за рамки данной главы. Мы остановимся поэтому только на некоторых принципиальных положениях. Нередко утверждалось, что построение крупных белковых молекул из не очень длинных пептидных цепей, образующих четвертичную структуру, позволяет снизить опасность ошибок трансляции. Действительно, даже одна ошибка в биосинтезе достаточно длинной полипептидной цепи, состоящей, например, из 1000 аминокислотных остатков, может дестабилизировать его структуру и сделать весь синтез бессмысленным. В том случае, если белок такого же размера был бы построен, например, из четырех субъединиц по 250 аминокислотных остатков каждая, такая же ошибка вызовет потерю только одной субъединицы.
Эти соображения, видимо, несправедливы, поскольку, как выяснилось в последнее время, многие белки синтезируются в виде очень длинных (по нескольку тысяч аминокислотных остатков) предшественников, так называемых полибелков, в дальнейшем нарезаемых на функциональные .глобулы. Следовательно, ошибки трансляции не накладывают серьезных ограничений на размер пептидной цепи, по-Ш
