Использование ЭВМ в молекулярной биологии. Введение в теорию генетических текстов - Соловьев В.В.
Скачать (прямая ссылка):
I I
13
синтезируемые цраймосомой, продлеваются холоферментом ДЖ-по-лимеразой III, ДНК-полимераза I вырезает праймеры и заполняет бреши, а ДНК-лигаза сшивает концы, продуцируя ковалентнозамкнутую двухцепочечную молекулу репликативной формы, которая в дальнейшем реплицируется по механизму катящегося кольца /22; 25/.
Двухсторонняя репликация двухцепочечного фага лямбда инициируется в уникальном сайте, который локализован в районе 80 % генетической карты фага /26/. Для разных цепей существует ряд различных сегментов ДНК, контролирующих инициацию репликации /27/. С помощью группы точечных мутаций, которые предотвращают Я-репликацию в цисположении, и других генетических экспериментов была локализована небольшая область в районе 39930 - 40000 п.н. на карте Л , которую назвали генетическим J-osI. Эта область расположена внутри гена 0-белка /28/, а ее функциональная минимизация при клонировании в плазмиде позволила определить фрагмент длиной 202 п.н., существенный для инициации левостороннего синтеза лидирующей цепи /26 - 29/. Дополнительные последовательности л -фага, обеспечивающие двухстороннюю репликацию, называют вторичными сигналами (ice -сигналами от incepior ) /27/.
Поскольку основные ферменты репликации - ДНК-полимераза III и праймаза - требуют одноцепочечной ДНК-матрицы, предполагается, что раскрытие двойной спирали осуществляется в результате транскрипционной активации. Действительно, показано, что нормальная инициация репликации требует транскрипции с PR-промотора, за которым следуют гены 0 и Р (даже если белки О и Р добавляются в систему) /10; 27/. Три особенности OKI -района могут вносить дополнительный вклад в сохранен!® мета-стабильной структуры открытой двойной спирали, достаточной для того, чтобы цраймаза могла взаимодействовать с сигнальными последовательностями. Во-первых, А - Т-богатая центральная часть. Во-вторых, насыщенность прямыми и инвертированными повторами левого A-участка от , которые могут формировать вторичные структуры, ускоряющие денатурацию ДНК. В-третьих, левая С-область может формировать альтернативные шпилечные структуры, сходные с прокариотическими сигналами терминации транскрипвди /27/. Анализ делеционных мутантов от показал;
14
лишь удаление фрагмента В полностью блокирует инициацию репликации, что свидетельствует в пользу локализации в этом участке промотора для праймазы. Сравнение нуклеотидных последовательностей об г лямбдоидных фагов, бактериальных хромосом с on I комплементарной цепи фага 64 и родственных ему фагов позволило выявить цромоторный консенсус для праймазы (рис. 6) /27/ (области наиболее высокой гомологии приведены в прямоугольниках),
2.1,3. Контроль пашоткашга у плаямитг. рассмотрим регуляцию репликации в плазмидах на примере colBl I. coli . Репликация этой плазмида in vitro не требует синтеза белков. На первом этапе РНК-полимераза синтезирует транифипт, начинающийся за 585 п.н. до начала репликации и проходящий через от. Вблизи OBI часть этого транскрипта образует гибрид с ДНК-ма?рн-цей. Этот гибрид расщепляется РЖ-зой Н, в результате чего генерируется З’-ОН конец а от области, использующийся как цраймер для синтеза ДНК ДНК-полимеразой I (рис. 7) /30/ (прай-мерные транскршты стартуют за 555-м нуклеотидом до OR! ; окружностью обозначена РНК-полимераза, треугольником - OBI ).
Промотор
Праймера
а
on
w_ Рис. 7. Два типа транскриптов в
-555 Г --области плазмиды: а - ини-
_ ______________-X. циация транскрипции; б - элон-
''А/Цд. т гация; в - формирование гнбрвд-
?...........ного комплекса; г - разрезание
РНК-зой; д - присоединение --L- "--djfifp днк-шлимеразой I; е - элонгация синтеза ДНК и отщепление праймера /30/.
о 1 t U 1 |,'| 1 UOOO 1 1
V- *— *— *— *— »— >- >— «—
о «с *— »— •- о‘ о 1
J--C U >— t— •ж 1
U <0 (0 •« —К 1
«?« и ?<с -«* о о о •— >— 1
•CS к- <« I— ?*« >« 1
Л СЭ СЭ ta <0; <U9' О S9 1
со О ta to Xj к to из
U «I <_э <U w >- *—
*- ?— •7^ ь- t
•SS. xo хд н- »—
о о о о о
?— и- »— ?— 5—_ ?— ?- ?- *— >—
ь- 1— »— t— ?— t— ?— •— ?— ?—
to о u и «* •л. ?«S С0
«в ?— <л <0 *— ?— *— *— MJ
?— ?— >— ?— »— ?— *~ •—
СО < •** (_Э •« <J3 ?«с
(— U *— ?— to и (0 о «К
(0 4С < •« ?« <-9 С-Э
«с < < •«К ?«t «с <
(О <_> с» <_3 ?« ?«
-«с «С «с «с
?- *— ?— 1— »— СО
ь- ?— к- •— к— •с
о <_> о ?— *-« О о 1
со (0 C0 «I ?«г
<«с < •« ?« «« «с
CD «а о tO сэ о «с о U
< У— »—
(в <а -« tO о (0 СО со о С9
«« < «X -а: -* -«
«К •«к •к* < «с ?«S <
«с «X «с ?в «J ?« •<* ?« «X -t
•ЧС «« -4 < -Г ?« ?« <
•«г < «с U и ?« -К -«
О о о о о < -* U о о
&
• и U L> чс О С-Э О О • I eg и и и> 4 '
U U о и у 10 (9 (0 (Я <
^1т
U и U О
и о о о у ? ?о> <oi '*S% iS' < ;oi i« k->; iu>: -с ?
§
16
репрессоры
Рис. 8. Структура транскрипционной единицы прокариот
Два явления, отмеченные при изучении плазмид, обусловлены регуляпдей репликации. Одно из них - постоянство числа копий (контроль числа копий) плазмиды в клетке, а другое состоит в неспособности сохранения двух близко связанных плазмид вместе в растущих клетках (несовместимость). Показано, что эти эффекты в различных й^Ж-связанных плазмидах осуществляются за счет ингибирования формирования РНК-праймера для данной или родственной плазмиды с помощью РНК. Эта РНК-1 считывается в районе ORI в направлении, противоположном праймерному трая-скрипту /30/.
