Методы очистки белков - Скоупс Р.
Скачать (прямая ссылка):
Нет сомнений в том, что при использовании смесей белков, удовлетворяющих критериям их стабильности и растворимости в изоэлектрической точке, изоэлектрическое фокусирование обладает наивысшей разрешающей способностью, хотя этот метод не позволяет разделять белки в зависимости от величины их молекул. Так, если изоэлектрическое фокусирование применяют как решающий аналитический тест для проверки гомогенности полученных препаратов, то часто в предположительно чистых белках обнаруживают много дополнительных небольших полос. Однако известны примеры, когда взаимодействие между белками и амфолитами с очень близкими изоэлектрическими точками приводит к артефактам — появлению нескольких полос. Поскольку амфолиты не проявляют некоего непрерывного набора свойств, а представлены отдельными веществами с близкими, но дискретными изоэлектрическими точками, они также способны фокусироваться, в результате чего образуются полосы
Разделение в растворе
231
[144]. Если амфолит с изоэлектрической точкой 6,1 сильно взаимодействует с белком, имеющим ИЭТ 6,0, возникает конъюгат с промежуточной ИЭТ. Из-за низкого заряда каждого из этих двух компонентов вблизи pH 6,0 электродвижущие силы оказываются недостаточными, чтобы их разделить. Поэтому белок с ИЭТ 6,0 в составе конъюгата может дать дополнительную полосу вблизи этого значения pH, что будет обусловлено не гетерогенностью белка, а его взаимодействием с дискретными молекулами амфолита. Это явление можно в той или иной степени устранить, если использовать набор амфолитов с большим числом индивидуальных компонентов. В таком случае конъюгаты будут иметь ИЭТ, столь близкие к ИЭТ белков, что дискретные полосы не будут выявляться. Единственным следствием образования конъюгатов будут диффузные полосы белков.
Значительные усилия были затрачены на разработку буферов, содержащих вместо дорогих амфолитов низкомолекулярные вещества с низкой проводимостью, способные образовывать градиент pH ([145—147]. Хотя в таких системах удавалось добиться удовлетворительного разделения, разрешение полос из-за более высокой проводимости этих веществ никогда не было столь же впечатляющим, как в случае полимерных амфолитов.
Изотахофорез — это третий метод разделения белков в электрическом поле. Простой электрофорез, осуществляемый в постоянном электрическом поле при постоянном pH, основан на разделении молекул по их истинной подвижности. В методе изоэлектрического фокусирования используется постоянное электрическое поле и градиент pH, что позволяет компонентам смеси двигаться до тех пор, пока они не станут электроней-тральными. В методе изотахофореза также создается градиент pH и все компоненты движутся в электрическом поле с одинаковыми скоростями, но напряженность электрического поля в точках локализации каждого компонента различна. Разделение происходит на основе различий в подвижности компонентов (подвижности на единицу напряженности поля), тогда как истинные скорости каждого компонента остаются идентичными. Чтобы получить различную напряженность электрического поля в разных точках, не требуется какого-то сложного оборудования для управления градиентом напряжения. Система является самоформирующейся (так же, как и система создания градиента pH при изоэлектрическом фокусировании), при условии что отсутствует избыток токопроводящих ионов, которые могли бы разрушить границы между компонентами. В отсутствие ионов с промежуточной подвижностью два типа одинаково заряженных ионов, имеющих разную подвижность, будут разделяться до тех пор, пока все ионы, движущиеся быстрее, не ока-
232
Глава 5
Г раница, сдвигающаяся к аноду
©-
©-*-
-на
*-s
—а е—
—в
©—
-на
©-*
©—*
в
«из
©-
-из
—а
*43
—а
-из
© Анионы С НИЗгчОИ подвижностью
• Анионы с высокой подвижностью
|+1 Катионы (подвижность может быть средней)
Рис. 5.24. Возникновение дискретных зон Кольрауша в процессе изотахофо-реза (см. также рис. 5.18,5).
жутся впереди более медленных ионов; в этой точке между ними образуется четкая граница. На самом деле быстрые ионы не могут двигаться впереди медленных так, чтобы между ними возникало пустое пространство, поскольку всегда есть противоионы, перемещающиеся в противоположном направлении через границу, заряд которой должен уравновешиваться при каждом ее положении. В результате возникает резкая дискретность (прерывистость) этих двух зон, которые называются зонами Кольрауша (рис. 5.24).
Если ионы, о которых идет речь, представляют собой белки с разной подвижностью, они располагаются в соответствии с их подвижностью так же, как и все другие ионные компоненты. Обычно pH системы достаточно высок, так что большинство белков заряжены отрицательно и движутся в приложенном электрическом поле к аноду. Лучше доводить раствор белка до нужного pH катионным буфером, например трисом, а
