Методы очистки белков - Скоупс Р.
Скачать (прямая ссылка):
Практические этапы аффинной элюции
В этом разделе описываются этапы аффинной элюции. Образец уравновешивают в соответствующем буфере и наносят на ионообменную колонку, заполненную, например, КМ-целлюло-зой. Нужный фермент полностью адсорбируется; колонку с нанесенным образцом промывают небольшим количеством исходного буфера. Если эффект аффинной элюции значителен, то pH исходного буфера может быть тем же, что и pH буфера для элюции. Однако чаще pH в колонке повышают до соответствующего значения, при ^котором нужный фермент только начинает двигаться, например когда а = 0,95—0,90 (рис. 4.23 и 4.24). Затем на колонку наносят раствор лиганда, концентрация которого должна превышать по величине константу диссоциации-комплекса фермент — лиганд, и если фермента много, то общее количество лиганда, выраженное в молях, должно быть больше количества (в молях) центров связывания. С другой стороны,, концентрация лиганда не должна существенно изменять ионную-силу буфера. Максимальное количество используемого лиганда часто определяется соображениями стоимости, но если константа диссоциации его комплекса с белком достаточно высока и требуемые концентрации лиганда приводят к повышению ион-кой силы буфера, то может потребоваться введение стадии «вымывания подставным лигандом». В этом случае на этапе, предшествующем элюции, -используют соединение, имеющее .лют же' заряд, что .и лиганд, но не связывающееся с ферментом. Все-белки, которые выходят из колонки при повышении ионной си-
140
Глава 4
лы, удаляются на этом этапе. Теперь колонка подготовлена к аффинной элюции и «подставной» лиганд заменяется настоящим (рис. 4.24,В).
Если очистку фермента проводят на анионообменнике, то образец наносят при более высоких значениях pH, а элюцию осуществляют путем снижения pH. Однако следует помнить, что при использовании анионообменников лиганд должен быть положительно заряжен. Если добавлен отрицательно заряженный лиганд, эффект будет сложным. Наиболее вероятно, что сам лиганд^ йеспецифически заместит белки в процессе обычно-хо ионного "обмена; при этом он свяжется с ионообменником йолее прочно, чем белки. Кроме того, лиганд специфически свяжется со своим ферментом, но это должно привести (по крайней мере теоретически) к более прочной адсорбции фермента, так как он приобретет при этом еще больше отрицательных за-;рядов. Была сделана попытка использовать «отрицательную ^аффинную элюцию», при которой связанный на колонке фер-
Рис. 4.26. «Отрицательная аффинная элю-ция» с использованием акионообменника и отрицательно заряженного лиганда. Л. Кривые зависимости а от pH в присутствии и в отсутствие лиганда. Б. Профиль элюции. После адсорбции белков при рНл величину pH снижают в присутствии лиганда. Неспецифические белки с низкими величинами а при pH в элюируются. Затем лиганд удаляют из буфера, вследствие чего а для выделяемого фермента снижается (см. рис. А) и фермент элюируется (заштрихованная область). Учтите, что лиганд в условиях опыта не должен связываться с адсорбентом.
Разделение белков путем адсорбции
141
мент промывают сначала буфером с критическим значением pH в присутствии его лиганда, а затем вымывают в отсутствие лиганда. Этот способ может дать хорошие результаты, если ионные условия таковы, что лиганд адсорбируется на иоЯообмен-нике лишь в незначительной степени. Лиганд должен иметь не более одного отрицательного заряда, в противном случае он почти наверняка будет связываться с ионообменником (рис. 4.26).
Некоторые теоретические расчеты
На основе экспериментальных данных, полученных на очищенных ферментах [38], можно провести некоторые расчеты и сравнить их результаты с экспериментальными данными исходя из предположения, что в процессе связывания достигнуто равновесие. Развивая идеи, представленные в разд. 4.1, можно написать следующие равновесия для белка Р, связывающегося с п молекулами лиганда L в присутствии адсорбента, имеющего концентрацию эффективных центров связывания, равную Af;
Р + М -7---» РМ KP
Р + L < -Е. PL Kl1
PL + L ч=± PL. Kl*
PLn-i + ^ •*--- PLn KLn
PL + M <---*¦ PLM KP1
PLt + M ч--->- PLfM Kf>*
PLa + M PLnM Kjfl
[PL] + [PLM]
По определению, связывание каждой следующей молекулы лигаида ослабляет взаимодействие белка с адсорбентом, т. е. /СряЖрп~|>...> >Кр1Жр. Так как практически невозможно определить промежуточные величины К1р> целесообразно рассмотреть только два случая. Во-первых, когда п= 1, можно измерить величину К1р, используя величину а при насыщающей концентрации L (рнс. 4.27). Вот пример моновалентного фермента:
p_|_Af ^—h РМ Кр
P + L*=*PL Kl
PL+M PLM Kpx
\PL] + [PLM] „
Значение a=---------—----- будет корнем кубического уравнения с изве-
стными коэффициентами Кр, Kl, Klp> I (= концентрации L), пц и ри Наоборот, зная величины Кр, К}р (исходя из eta, ад рис. 4.27), /, mt
