Методы очистки белков - Скоупс Р.
Скачать (прямая ссылка):
112
Глава 4
модификации не только снижает емкость, но и уменьшает проч*.. ность связывания, служит ослабление электростатических вза-‘ имодействий между белком и адсорбентом с малым количеством заместителей на единицу объема.
Величина pH и эффект Доннана
Значение pH в микроокружении ионообменника отличается от его значения в наносимом на колонку или вытекающем из колонки буфере, так как протоны внутри матрицы адсорбента могут отталкиваться или притягиваться за счет эффекта Доннана. В общем pH матрицы бывает обычно на 1 единицу выше, чем pH окружающего буфера, в анионообменнике и на 1 единицу ниже — в катионообменнике (рис. 4.11). Чем ниже ионная сила буфера, тем значительнее эта разница. Такое явление имеет очень важные последствия, когда речь идет о стабильности фермента в зависимости от pH. Фермент, стабильный при pH
5,5, может быстро денатурировать в растворе при pH 4,5. Если такой фермент адсорбируется на катионообменнике при pH 5,5, то он оказывается в микроокружении с pH ниже 5,5 и вероятность его денатурации на адсорбенте повышается. Поскольку эффект Доннана приводит к сдвигу величины pH в сторону крайних значений, это заметно ограничивает интервал значений pH, при которых можно работать на ионообменниках, особенно слабокислую область в случае катионообменников. Как правило, ферменты имеют тенденцию сохранять большую стабильность в слабощелочной среде, например при pH 8—10, чем
рН'9 рН~8 pH ~ 5 рН~6
Рис. 4.11. Влияние эффекта Доннана на pH в микроокружении ионообмен-ников. А. Протоны выталкиваются из непосредственного окружения анионо-обменника, а гидроксил-ионы притягиваются к нему. Б. Протоны притягиваются к непосредственному окружению катионообменника, а гидроксил-ионы выталкиваются.
Разделение белков путем адсорбции
113;
в слабокислой (pH 6—4), так что при использовании анионооб-менников потери белка в результате денатурации оказываются, меньше.
Элюция адсорбированного белка
Теоретически существуют два общих метода элюции белков^ (не считая аффинной элюции, разд. 4.4): а) изменение pH буфера до величины, при которой связывание белка с адсорбентом ослабевает; для анионообменников используют более низкие значения pH, а для катионообменников — более высокие; б) повышение ионной силы, что вызывает ослабление электростатического взаимодействия между белком и адсорбентом. На практике метод а не всегда дает хорошие результаты. Это объясняется тем, что при недостаточно высокой буферной емкости резкое и значительное изменение pH по мере элюции белков приводит к плохому разделению индивидуальных компонентов. При' низкой ионной силе буферная емкость должна быть низкой, и попытка изменить значение pH, используя градиент pH, оказывается тщетной из-за буферной силы белков, адсорбированных на колонке, а в случае использования ДЭАЭ-адсорбентов— из-за буферных свойств самого адсорбента. Типичный результат показан на рис. 4.12. Градиент pH может быть успешно использован только тогда, когда интересующие нас белки первыми и очень прочно адсорбируются на ионообменнике. В этом случае можно использовать сильное забуферивание растворов при ионной силе 0,1 и больше. В одной из работ [29] была предложена схема получения сильных буферных градиентов pH при постоянной ионной силе.
Благодаря дальнейшему развитию методов элюции белков с ионообменников путем изменения значений pH этот подход стал значительно более успешным. Слюйтерман и др. [42—45] разработали способ, названный «хроматофокусированием», в котором градиент pH создается с помощью буферов амфолит-ного типа, обладающих высокой буферной емкостью, но низкой эффективной ионной силой. В качестве ионообменника предложен полиэтилениминагароза, которая, несмотря на ее сходство с ДЭАЭ-адсорбентами, непрерывно титруется в широкой области значений pH. Фирма Pharmacia выпускает эту систему, состоящую из буферных растворов и ионообменника, под названием «полибуфер» и «полибуферный ионообменник» [46]. Градиент pH не создается перед тем, как буфер поступает в колонку, а генерируется в самой колонке путем непрерывного добавления кислой формы амфолита. В результате из колонки выходит очень устойчивый градиент pH с низкой ионной силой. Выход белков происходит в их изоэлектрических точках или не-
pH
10
9
8 Рн 7
Рис. 4.12. Примеры неупорядоченных градиентов pH, полученных на колонках с ДЭАЭ-сефадексом. После начала элюирования при pH 10,1 были использованы буферы с pH 8,0 (Л) и 7,5 (Б). Значение pH снижается неупорядоченно и резко падает, когда белок (непрерывная линия) полностью выходит из колонки [44].
ОП
280
“|9 pH
Объем, мл
Рис. 4.13. Разделение смеси, состоящей из миоглобина кашалота, миоглобина лошади и карбоксигемоглобина (по 2 мг каждого), с помощью хроматофокусирующей системы. (С любезного разрешения фирмы Pharmacia Fine Chemicals [46].)
Разделение белков путем адсорбции
11S
сколько выше их. Разрешающая способность метода очень велика, во многих случаях больше, чем при обычном солевом градиенте, о котором речь пойдет дальше. Считается, что каждый компонент может быть полностью элюирован в пределах 0,05 единицы pH, но это, вероятно, оптимум, которого средний белок не достигает. В качестве примеров можно привести белки, хорошо титрующиеся вблизи их изоэлектрической точки, что является необходимым условием для их «изоэлектрического» разделения (рис. 4.13). Несомненно, этот метод элюции даже с использованием обычных ионообменников найдет широкое применение в будущем, хотя при крупномасштабном выделении белков следует принимать в расчет соображения о соотношении эффективности метода и его стоимости.
