Методы очистки белков - Скоупс Р.
Скачать (прямая ссылка):
Пробы на тепловую денатурацию следует производить при' различных значениях pH. Цель в этом случае заключается в том, чтобы получить максимальное осаждение ненужных белков, при заданной, например 90%-ной, степени сохранения активности фермента. Используя экстремальные значения pH, этот результат можно получить при более низких температурах. Теперь этот процесс получил название рН-денатурации.
Разделение белков путем осаждения
87
Денатурация путем изменения pH
Чем больше отличается pH среды от физиологических значений pH для данного фермента, тем менее стабильным оказывается фермент. Однако следует отметить, что это не обязательно происходит при значениях pH, отличных от нейтральных. Например, пепсин достаточно стабилен и имеет нормальную активность при pH 1—2, но быстро денатурирует при pH 7 и выше. Оптимальная стабильность фермента не всегда наблюдается при значении pH, оптимальном для его функционирования, а оптимум pH часто не совпадает с физиологической областью pH. Последнее обусловлено тем, что условия эксперимента, при которых фермент насыщен субстратом, не обязательно соответствуют физиологическим условиям. Тем не менее предполагается, что фермент наиболее стабилен при физиологических или близких к ним значениях pH.
При экстремальных значениях pH происходит денатурация, так как в этих условиях некоторые участки белковой молекулы приобретают большее число зарядов одного знака, что приводит к отталкиванию между ними, или, возможно, наоборот, эти участки теряют заряды, обеспечивающие притяжение меж-
Рис. 3.16. Электростатические силы, действующие внутри белковой молекулы, ослабевают в результате протонирования, что приводит к разворачиванию молекулы и к полной денатурации.
88
Глава 3
ду отдельными участками и тем самым стабилизирующие структуру молекулы (рис. 3.16). Значение pH, при котором сохраняется наибольшая стабильность фермента, не обязательно соответствует изоэлектрической точке. Изоэлектрическая точка большинства бактериальных белков лежит в пределах pH 4—5, но именно в этих условиях они не стабильны. Дело в том, что в клетке они существуют при pH 6—7. Однако чувствительные к pH участки молекулы, показанные на рис. 3.16, могут находиться в «изоэлектрической» точке при физиологическом значении pH.
Скорость денатурации в кислых или щелочных условиях не совпадает со скоростью стадии протонирования, показанной на рис. 3.16. Протонирование и депротонирование заряженных групп происходят практически мгновенно. Скорость всего процесса определяется стадией разворачивания глобулы. Последний процесс протекает, в сущности, так же, как и при «тепловой» денатурации. Таким образом, температура — это очень важный фактор. При экстремальных значениях pH температура в области 0—10 °С может оказывать более сильное денатурирующее воздействие, чем в области 50—60 °С. Так как значительные изменения могут происходить даже при изменении температуры всего на несколько градусов, рН-денатурация должна проводиться при тщательно подобранной температуре. Поскольку pH можно быстро снизить до требуемой величины и вновь повысить (или, наоборот, повысить его и снова снизить), не возникает трудностей, обусловленных медленным приближением к выбранным условиям при проведении этой процедуры в больших масштабах. Кроме того, pH следует доводить до нужного значения подходящим основанием или кислотой (см. разд. 6.1). Необходимо по возможности избегать сильных кислот и щелочей. В области pH 5—8,5 можно использовать трис и уксусную кислоту; более сильные кислоты и щелочи нужны только за пределами этих значений pH. Молочной кислотой можно доводить pH приблизительно до 4,0, для более низких значений может потребоваться фосфорная или даже серная кислота. Если фермент стабилен при pH 2, мало вероятно, что кратковременный контакт с каплей сильной кислоты повредит именно этому ферменту, а не белку, денатурация которого происходит при pH 5. Для создания высоких значений pH используют диэтаноламин (до pH 9) или карбонат натрия (до pH 10,5); для доведения pH до 11 и выше применяют гидроокиси калия и натрия. Вполне вероятно, что в области этих экстремальных значений pH существенная часть денатурированных белков остается в растворе даже при средней концентрации соли. Но при последующем доведении значения pH до нейтрального денатурированные белки обычно осаждаются. Рекоменду*
Разделение белков путем осаждения
89
ется после нейтрализации провести короткую инкубацию смеси при 25—30 °С, для того чтобы перед центрифугированием произошла полная агрегация денатурированных белков.
Денатурация органическими растворителями
В разд. 3.4 описано использование органических растворителей для осаждения белков при низких температурах. Чтобы избежать денатурации белков, температура поддерживается около 0°С. В этом разделе речь идет о применении органических растворителей для денатурации. При этом обычно используют температуру от 20 до 30 °С или даже выше; концентрация же органического растворителя обычно ниже, чем это требуется для осаждения нативных белков.
