Методы очистки белков - Скоупс Р.
Скачать (прямая ссылка):
Если кристаллизацию используют как способ очистки, то все описанные выше процедуры проделывают гораздо быстрее; некоторое избыточное количество сульфата аммония может быть сразу добавлено после центрифугирования, и как только появятся кристаллы (их идентифицируют по появлению муарового блеска при встряхивании), можно еще добавить сульфат аммония. Важно выделить как можно больше фермента, оставив в растворе только минимальное его количество, хотя всегда имеется опасность, что при дальнейшем добавлении сульфата аммония начнет выпадать какая-нибудь примесь. Вторая кристаллизация позволяет избавиться о^г следовых количеств примесей. Вследствие того что концентрация примесей с каждым циклом снижается, для их осаждения нужен все более высокий уровень содержания сульфата аммония, тогда как для кристаллизации очищаемого белка этого не требуется. Из-за стабилизирующего влияния сульфата аммония время, необходимое для проведения кристаллизации, не является критическим, лимитирующим, фактором (ср. разд. 7.1). Однако если кристаллизация проводится при низкой ионной силе, длительность процесса должна быть минимальной, чтобы избежать опасности протеолиза или бактериального загрязнения.
Очень желательно закристаллизовать фермент сразу по окончании его очистки. Это делается не только для того, чтобы показать, что фермент чистый и находится в стабилизирующих условиях, но и для того, чтобы убедиться в ненужности какой-либо дальнейшей его очистки. Выделение завершено, и можно приступить к характеристике ферментного белка.
Этими замечаниями по кристаллизации мы заканчиваем книгу и надеемся, что многие исследователи, занимающиеся очисткой ферментов, теперь смогут быстрее реализовать свои планы
Определение чистоты белков; кристаллизация
ЗЗГ
и согласятся с автором, что очистка белка — это не просто каторжный труд и не поиски случайной удачи, а вполне респектабельное и приносящее удовлетворение занятие.
РЕКОМЕНДУЕМАЯ ЛИТЕРАТУРА
Gordon А. Н. (1979). Electrophoresis of proteins in polyacrylamide and starch) gels. In: Laboratory techniques in biochemistry and molecular biologjr (Work T. S. and Burdon R. М., eds.), vol. 1, Part I, EIsevier/North-Holland* Amsterdam.
Hames B., Rickwood D. (1981). Gel electrophoresis of proteins, IRL Press, London.
ПРИЛОЖЕНИЕ А
Этот раздел содержит таблицы для расчета количества оса-дителя, которое необходимо добавить в раствор.
Таблица I: Твердый сульфат аммония.
Количество сульфата аммония (твердого), которое необходимо добавить к раствору, уже содержащему эту соль со степенью насыщения Si%, для того чтобы получить степень насыщения S2%. Для 1 л раствора:
Таблица II: Органический растворитель, или насыщенный сульфат аммония.
Объем смешивающейся жидкости (органического растворителя или насыщенного раствора сульфата аммония), который необходимо добавить к раствору, уже содержащему Ci% (по объему) этой жидкости, для получения концентрации С2% (по объему). Для 1 л раствора:
Количество (г) =
533 (S2 — S?) 100 — 0,3S2 *
Объем (мл) =
Ю(Са-Сд) 100 — с2
Таблица I. Количество сульфата аммония (в граммах), добавляемое к 1 л раствора
От До 5 10 15 20 25 30 35 40 45
St % Ss%-
0^ 27 55 84 113 144 176 208 242 277
5 27 56 85 115 146 179 212 246
10 28 57 ?6 117 149 182 216
15 28 58 88 119 151 185
20 29 59 89 121 154
25 29 60 91 123
30 30 61 92
35 30 62
40 31
45
50
От 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 '
0 314 351 390 430 472 516 561 608 657 708 761 •
5 282 319 357 397 439 481 526 572 621 671 723
10 251 287 325 364 405 447 491 537 584 634 685
15 219 255 292 331 371 413 456 501 548 596 647
20 188 223 260 298 337 378 421 465 511 559 609
25 157 191 227 265 304 344 386 429 475 522 571
30 126 160 195 232 270 3G9 351 393 438 485 533
35 94 128 163 199 236 275 316 358 402 447 495
40 63 96 130 166 202 241 281 322 365 410 457
45 31 64 97 132 169 2С6 245 286 329 373 419
50 32 65 99 135 172 210 250 292 335 381
55 33 66 101 138 175 215 256 298 343
60 33 67 103 140 179 219 261 305
65 34 69 105 143 183 224 266
70 34 70 107. 146 186 228
75 35 72 110 149 190
80 36 73 112 152
85 37 75 114
90 37 76
95 38
Таблица II. Объем растворителя (в мл), добавляемый к 1 л раствора
От До 5 10 15 20 25 30 35 40 45
Ci% са%-
