Методы очистки белков - Скоупс Р.
Скачать (прямая ссылка):
Этот, третий по счету метод электрофореза также можно использовать для разделения белков, нерастворимых при низкой ионной силе; в настоящее время он очень широко применяется для всех типов белков. В этом методе белки денатурируют анионным детергентом — додецилсульфатом натрия (рис. 9.3). Часто этот метод сокращенно обозначают как ПАГЭ-ДСН (электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия). ПАГЭ-ДСН, обладающий высокой разрешающей способностью, покорил химиков, работающих с белками. Причина кроется в том, что разделившиеся зоны белков не только можно охарактеризовать по их относительной подвижности, но и определить размеры соответствующих молекул, поскольку при использовании этого метода полипептидные цепи делятся по размерам. Додецилсульфат натрия сильно связывается с бел-
Определение чистоты белков; кристаллизация
Нативный белок + ДСН несущего сильноотрицательный заряд
Рис. 9.3. Денатурация белков под действием додецилсульфата натрия.
ками [180], так что достаточно только 0,1%-ного раствора этого детергента, чтобы насытить им полипептидные цепи. При этом связывается приблизительно 1 молекула детергента на
2 аминокислотных остатка. Каждая молекула ДСН несет отрицательный заряд, поэтому типичный полипептид с мол. массой 40 000 приобретает около 180 отрицательных зарядов — это гораздо больше любого суммарного заряда, который может существовать (при нейтральном pH) на полипептидной цепи в исходном состоянии (без детергента). Следовательно, отношение заряд/размер в присутствии ДСН становится фактически одинаковым для всех белков, и их разделение происходит благодаря тому, что поры в геле действуют как молекулярное сито. И хотя в данной системе невозможно разделить белки одинаковых размеров, тем не менее этот метод дает наивысшее разрешение и самые четкие зоны по сравнению с любым другим методом. Более того, с помощью смеси стандартных полипептидов известной молекулярной массы гель можно прокалибровать в отношении зависимости подвижности молекул от их размеров. График такой зависимости обнаруживает линейность в широком интервале значений, если подвижность откладывают против логарифма молекулярной массы (рис. 9.4) [132].
При определении чистоты препарата фермента всегда надеются, что в образце содержится только один компонент; но если их оказывается несколько (и положение интересующего нас фермента может быть точно установлено), то начинается работа по идентификации возможной природы примесей. Не исключено, что при этом будут сделаны ошибочные выводй, но все же вполне вероятно, что примесь будет идентифицирована по ее молекулярной массе. Например, фосфоглицераткиназа, выделенная из листьев свеклы после очистки с помощью гель-фильтрации, по-прежнему содержала существеннное количество какой-то примеси {181]. Поскольку молекулярная масса мономера фосфоглицераткиназы равна приблизительно 45 000, а полоса примеси соответствовала мол. массе 26 000, было сделано за*
322
Глава 9
Рис. 9.4. Зависимость подвижности белков при гель-электрофорезе в присутст-
^7 v11V*- IV I U 11 р f i 1^*
^ вии додецилсульфата нат*
пип ГЧ'Т' ПАГО глтл+тл о НЛП not/V.
рия от логарифма молекулярной массы для ряда очищенных белков.
Логарифм молекулярной массы
ключение, что эта примесь является димером с мол. массой
52 000, который плохо отделяется при гель-фильтрации. Хорошо известный фермент метаболизма углеводов, триозофосфатизо-мераза (из дрожжей или мышц), представляет собой димер с мол. массой 2x26 500, и, действительно, результаты ферментативных тестов показали, что этот фермент присутствует в препарате фосфоглицераткиназы как примесь. Полное отделение фос-фоглицераткиназы от примеси было достигнуто с помощью аффинной хроматографии на голубом сефадексе.
Очевидно, что примесь белка с абсолютно таким же размером субъединицы, как и у выделяемого фермента, не будет выявлена в данной системе; однако при оптимальных условиях возможно разрешение компонентов, различающихся по молекулярной массе всего лишь на 1%. Это не означает, что в действительности отношение подвижность/молекулярная масса находится точно в пределах 1%. Более строго следовало бы говорить о разрешении компонентов, у которых различия в подвижностях соответствуют разнице в 1% по молекулярной массе; на самом же деле их молекулярные массы могли бы быть идентичными. Надо заметить, что многие белки состоят более чем из одного типа субъединиц, так что множественность полос не обязательно свидетельствует о наличии в образце примеси. Если предполагается именно такая ситуация, то должно быть разумное соотношение между интенсивностями множественных компонентов. Например, белок с субъединичной структурой <*2р2, у которого а-субъединица имеет мол. массу 50 kD (килодальтон, или мол. массах 10~3), а (5-субъединица— мол. массу 30 kD, должен давать две полосы, причем интенсивность окраски в 30к1)-полосе будет составлять только 60% интенсивности окраски в 50к0-полосе в соответствии с количеством содержащегося в них белка. Некоторые замечания по оценке относительных интенсивностей будут сделаны позднее.
