Методы очистки белков - Скоупс Р.
Скачать (прямая ссылка):
Сопряженные методы
Принцип сопряженных методов заключается в том, что продукт реакции, который нельзя обнаружить непосредственно, выделяется и подвергается химическому или ферментативному превращению прямым или косвенным путем в соединение, которое можно выявить тем или иным способом. Добавляемые реактивы, конечно, должны действовать в тех же условиях (pH, температура и т. д.), что и фермент, активность которого измеряется, и не должны влиять на ферментативную активность. В большинстве методов используется свойство ферментов проявлять специфичность по отношению к определенному веществу, что позволяет избирательно воздействовать на продукт и продолжить «мини-цепь» метаболических превращений до тех пор, пока не получится вещество, которое можно определить каким-либо способом. Однако имеется несколько прямых хими-
'ТНБ
Рис. 8.7. Реакция ДТНБ с сульфгидрильпымн соединениями, приводящая к образопаниго окрашенного продукта.
296
Глава 8
ческих методов, включающих реакцию, в которой образуется окрашенное вещество. Особое значение имеет 5,5'-дитиобис(2-нитробензойная) кислота (ДТНБ), реагирующая в нейтральной области pH с сульфгидрильными группами с выделением 5-тио-
2-нитробензойной кислоты (ТНБ), за которой можно наблюдать при 412 нм (рис. 8.7). Этим способом можно определять ферменты, использующие ацил-СоА и образующие СоА:
Ацил-S-CoA+HX —»- Ацил-Х -j- HS-CoA
HS-CoA-f ДТНБ —> THB-S-CoA+THB
Однако ферменты, содержащие реакционноспособные сульф-гидрильные группы в активном центре, будут, скорее всего, инактивироваться этим реактивом.
Другой пример — это реакции переноса электронов такими ферментами, как гидрогеназы: поглощение кислорода и перенос электрона на флаводоксины или ферредоксины можно наблюдать, используя синтетическое соединение и метилвиологен. Поглощение этого вещества в УФ-свете существенно снижается при его восстановлении:
1/2На —> [е‘] + Н+ —> Ферредоксин —> Метилвиологен
Имеется ряд других примеров сопряженных химических реакций. Однако в непрерывных методах определения активности ферментов значительно шире используются сопряженные ферментативные реакции. Принцип здесь прост, однако встречается много «подводных камней», особенно при использовании этого метода для определения активности в сыром экстракте. Продукт Р превращается сопрягающим ферментом Ер в другой продукт Q:
•В простейшем случае можно прямо следить за реакцией, катализируемой ферментом Ер. Например, нужно измерить активность фермента триозо-Р-изомеразы:
Глицеральдегид-З-Р —> Дигидроксиацетон-Р.
Образование продукта — дигидроксиацетонфосфата — нельзя измерить прямым способом. Его удаляют с помощью фермента глицерол-11-Р-дегидрогеназы, для действия которого необходим NADH:
Дигидроксиацетон-Р NADH ¦—Глицерол-1 -Р -f- NAD+
Хотя продукт этой реакции, глицерол-1-Р, нельзя измерить непосредственно, образование каждой его молекулы сопровождается расходованием молекулы NADH, что приводит к сии-
Измерение активности ферментов
297
жению поглощения при 340 нм. Сопрягающий фермент, глице-рол-1-Р-дегидрогеназа, служит в этом случае «индикаторным ферментом».
Теперь разберем более сложный процесс, в котором, однако, участвуют те же ферменты. Фруктозо-бисфосфатальдолазу обычно определяют с использованием как триозо-Р-изомеразы в качестве сопрягающего фермента (Ер), так и глицерол-1-Р-дегидрогеназы (Eq) в качестве индикаторного фермента:
Фруктозо-1, 6-бис-Р '
Ер NAD Н NAD"
Г лицеральдегид-З-Р
Можно было бы утверждать, что фермент Ер не нужен, так как дигидроксиацетон-Р уже образовался в альдолазной реакции. Однако добавление Ер имеет не только то преимущество, что чувствительность измерения при этом удваивается: оно также вносит уверенность в том, что эндогенная изомераза, которая может содержаться в образце, не исказит результатов из-
ТАТР ADP
Альдолаза
Рис. 8.8. Принцип сопряженного определения фосфофруктокиназы с использованием глицерол-1-Р-дегидрогеназы в качестве индикаторного фермента.
20—1078
298
Глава 8
мерения. Без избытка триозо-Р-изомеразы число молекул NADH, окисляемых на одну молекулу расщепляемого фрукто-зо-1,6-бис-Р, может изменяться от 1 до 2, вследствие чего будет наблюдаться нелинейность скорости окисления NADH.
Еще более сложным, но очень эффективным методом является метод определения фосфофруктокиназы. Используя ту же последовательность реакций, что и выше, но с альдолазой в качестве сопрягающего фермента, получают две окисленные молекулы NADH на каждую молекулу претерпевающего превращения субстрата (рис. 8.8).
Эти примеры показывают, как можно создать «мини-мета-болическую» последовательность реакций для определения активности фермента. Система должна быть термодинамически выгодной, чтобы продукт мог удаляться достаточно эффективно.
Иногда используют более чем одно определение. Например, фосфофруктокиназу определяют, применяя общие методы тестирования ADP с помощью пируваткиназы и лактатдегидроге-назы (рис. 8.9).
