Сельскохозяйственная биотехнология - Шевелуха Е.А.
Скачать (прямая ссылка):
III этап (1922—1932 гг.). В этот период независимо друг от друга американский ученый В. Робинс и немецкий ученый Котте показали возможность культивирования на твердых питательных средах меристемы кончиков корня томатов и кукурузы. Однако через определенное время растительные ткани бурели и погибали. Подлинное развитие метода культуры тканей растений началось с 1932 г.
IV этап (1932—1940 гг.) связан с именем французского ученого Р. Готре, который показал возможность долгого культивирования в условиях in vitro растительных тканей за счет периодического пересаживания их на свежую питательную среду. Это открытие дало новый толчок в работе по культуре ткани, который ознаменовался нарастающим числом новых объектов, успешно введенных в культуру.
V этап (1940—1960 гг.). С открытием в 1955 г. нового класса фитогормонов-цитокининов, и в частности кинетина, была получена возможность стимулировать деление клеток кусочка ткани сердцевинной паренхимы табака, лишенной проводя-
щих пучков и камбия. В зависимости от концентрации и соотношения стимуляторов роста можно было усиливать деление клеток экспланта, поддерживать рост каллусной ткани, индуцировать морфогенез. В этот период было оценено положительное действие натуральных экстрактов типа эндосперма кокосового ореха, каштана, кукурузы и других растений для поддержания неорганизованного клеточного роста и стимуляции процессов морфогенеза в культуре каллусных тканей и клеточных суспензий.
VI э т а п (1960—1975 гг.). Наиболее важным событием этого периода была разработка профессором Ноттингемского университета Э.К. Коккингом метода получения ферментативным путем изолированных протопластов из корней и плодов томата и культивирования их в контролируемых условиях. Позже в 1970 г. в той же лаборатории Пауэром с сотр. было осуществлено искусственное слияние протопластов, что открыло новый путь к созданию соматических гибридов. Еще один метод, разработанный в этот период,— это микроразмножение растений в условиях in vitro с использованием меристемной культуры. Первоначально этот метод был разработан французским ученым Ж. Морелем для получения оздоровленного посадочного материала орхидей.
VII этап (1975 г.— по настоящее время). Продолжается быстрое развитие техники in vitro, изучение биологии культивируемых объектов, разрабатываются методы электрослияния изолированных протопластов, методы мутагенеза и клеточной селекции, методы получения гаплоидных растений, совершенствуется метод глубинного культивирования клеток с использованием изолированных протопластов и векторов, созданных на основе Ti- и Ri-плазмид Agrobacterium tumefaciens и А. rhizogen.es. С помощью методов генной инженерии разработан эффективный метод переноса генов для двудольных растений. Таким образом, за последние десятилетия был сделан большой шаг вперед в развитии технических приемов работы с изолированными тканями и клетками растений. Однако объектом исследования, как правило, служили однодольные и двудольные травянистые растения и в редких случаях — древесные.
1.2. ТЕХНИКА ВВЕДЕНИЯ В КУЛЬТУРУ И КУЛЬТИВИРОВАНИЕ ИЗОЛИРОВАННЫХ ТКАНЕЙ РАСТЕНИЙ
Необходимым условием работы с культурой изолированных тканей является соблюдение строгой стерильности. Богатая питательная среда является прекрасным субстратом для разви-
10
тия в ней микроорганизмов, а изолированные от растения фрагменты (экспланты), которые помещают на питательную среду, легко поражаются микроорганизмами. Поэтому надо стерилизовать как эксплант, так и питательную среду. Все манипуляции с изолированными тканями (введение в культуру, пересадка на свежую питательную среду) проводят в асептическом помещении (ламинар-боксе) стерильными инструментами. Стерильность надо соблюдать и во время культивирования изолированных тканей, особенно при перепаде температуры и влажности, так как при этом пробки становятся влажными и по ним в пробирку могут проникать микроорганизмы.
Стерилизацию экспланта, а также семян проводят путем выдерживания их 5—20 мин в стерилизующих растворах с последующей многократной промывкой экспланта стерильной водой. Время стерилизации зависит от характера экспланта и от стерилизующей активности раствора. Обычно семена стерилизуют 10—20 мин, а вегетативные части 5—10 мин. Примеры стерилизующих растворов приведены в табл. 1.1.
Таблица 1.1. Стерилизация исходного растительного материала (Р.Г. Бутенко, 1990)
Объект Время стерилизации, мин
диацид, сулема, гипохлориты пероксид
0,1 %-иый 0,1 %-иая (Na, Са) водорода,
5---9 %-ный 10-12%-
ный
Семена 15---20 10---15 15---20 12--- Ю
сухие 6---10 6---8 10---15 6---8
набухшие 20---30 15---25 15---20 3---5
Тканн 20---40 20---25 20---25 2---7
мясистого корня, клубня 1-3 1---3 3---6
одревесневшего стебля 1---10 1---7 3---15
