Сельскохозяйственная биотехнология - Шевелуха Е.А.
Скачать (прямая ссылка):
Значительное влияние на процесс микроразмножения оказывают биологически активные вещества негормональной природы, а также углеродное питание. Как правило, присутствие в составе питательной среды витаминов, аминокислот, растительных экстрактов, гидролизата казеина необходимо для индукции пролиферации каллуса и регенерации из него побегов или эмбриоидов. Когда же развитие побегов происходит за счет существующих пазушных меристем или сформировавшихся почек и эмбриоидов, то обычно влияние биологически активных добавок становится несущественным, ибо побеги сами способны к синтезу нужных для их жизнедеятельности веществ. Было замечено, что высокие концентрации биологически активных веществ приводят к гипервитаминозу, что проявляется в угнетении роста, побурении и высыхании листьев, в изменении морфологии растений.
На всех этапах клонального микроразмножения в качестве источника углеродного питания используют 3%-ную сахарозу. Однако эта концентрация не является оптимальной для всех, вводимых в культуру in vitro растений. Так, например, экспериментально было доказано, что сахароза является фактором, способным направить развитие побегов каперса in vitro, и что можно получать либо вегетирующие побеги, либо пурпурные почки возобновления. При культивировании апикальных и боковых почек на среде, содержащей сахарозу в концентрации 3% и более, наблюдается появление антоциановой окраски почек, что является первым признаком перехода почек в состояние зимнего покоя. При использовании же пониженных концентраций (менее 3%) происходит формирование зеленых почек, способных в дальнейшем к размножению (С.А. Сафразбекян, В.В. Урманцева, Н.В. Катаева, 1991).
В работах с изолированными зародышами ели обыкновенной была также выявлена отрицательная роль высокой концентрации сахарозы (2—3%) на процесс образования адвентивных почек. Было показано, что уже на втором пассаже этот процесс практически не происходит, а к четвертому пассажу наблюдается гибель всех эксплантов. Пониженное содержание сахарозы в среде стимулировало не только образование адвентивных почек, но и дальнейшее их развитие в побеги. При 0,5—1%-ной концентрации сахарозы побеги через 2—3 месяца культивирования имели высоту 1 —1,5 см и затем использовались для дальнейшего размножения или укоренения.
Помимо сахарозы в качестве источника углеродного питания возможно использовать глюкозу, фруктозу, галактозу и др. Известно, что после сахарозы наиболее употребляемым источ-62
ником углеродного питания для культивирования in vitro тканей растений является глюкоза. Из 38 исследованных культур (травянистых и древесных) 85% имели отличный и хороший рост на среде с глюкозой. На третьем месте по эффективности использования культурами тканей растений стоит фруктоза. По мнению Миноха, 2/л культур успешно использовали для своего роста фруктозу. Галактоза — заметно отличается от глюкозы и фруктозы по действию на рост изолированных тканей растений. Более половины изученных культур слабо или почти не используют галактозу для роста. Однако есть данные, отмечающие положительную роль галактозы для культивирования тканей и органов растений.
Таким образом, проблема использования гормонов, биологически активных веществ и минеральных солей не должна сводиться к простому включению этих соединений в состав питательной среды по готовым стандартным рецептам, а должна решаться с учетом конкретных морфогенетических реакций, используемых для микроразмножения того или иного вида растений.
Физические факторы. Консистенция среды является важным фактором, влияющим на процессы роста эксплантов и образование адвентивных почек. Известно, что при культивировании эксплантов верхушки побегов в жидких питательных средах на аппаратах роллерного типа значительно стимулируется их рост, не наблюдается ярко выраженного апикального доминирования побегов, сокращается период выращивания и количество пересадок, что обусловливается хорошим снабжением растений питательными веществами. С другой стороны, в этих условиях возрастает возможность образования аномальных, витрифицированных побегов. Использование твердых агаризованных сред способствует преодолению витрификации, но, вместе с тем, этот способ выращивания ухудшает условия питания эксплантов и препятствует удалению продуктов метаболизма.
На клональное микроразмножение и рост растений также влияет и кислотность среды, определяющая доступность для растений питательных веществ. Известно, что сильно кислые или щелочные среды лимитируют поступление некоторых элементов, например, фосфора и железа, делая их относительно нерастворимыми и этим ограничивая рост растений. В то же время при высокой кислотности большое количество этих элементов переходит в растворенное состояние и становится токсичным для эксплантов.
Как правило, ткани и органы растений культивируют на питательной среде с pH 5,6—5,8. Однако эти условия не всегда
могут быть оптимальными. Например, для культуры зародышей сосны обыкновенной было показано, что изменение кислотности питательной среды от 4,7 до 5,2 позволяет увеличить в 2,5—3 раза способность зародышей образовывать адвентивные почки, а для культуры ели обыкновенной наиболее благоприятный pH среды находился в пределах 5,2—5,6. Эти данные полностью совпадают с кислотностью почвы, на которых успешно произрастают данные породы в естественных условиях. Поэтому биотехнологи должны учитывать в экспериментах по культуре ткани кислотность почв естественного произрастания исследуемых растений.
