Проблема белка. Том 3: структурная организация белка - Попов Е.М.
ISBN 5-02-001911-9
Скачать (прямая ссылка):
При конструировании пространственной модели апамина, как и тер-тиапина, MCD-пептида и секапина, Р. Хидер и У. Рагнарссон [91] использовали предсказательный алгоритм вторичных структур П. Чоу и Г. Фас-мана [94] с параметрами М. Левитта [95]. После структурной идентификации локальных участков цепи рассчитывался спектр кругового дихроизма, добиваясь совпадения с наблюдаемым спектром путем коррекции содержания вторичных структур. Расчет выполнялся при значениях эллиптичности а-спирали и беспорядочного клубка, полученных Н. Гринфилдом и Г. Фасманом [96], и (i-изгиба - С. Брахмачари и соавт. [97]. Окончательная структура состояла из неупорядоченного нонапептидного N-koh-цевого участка и такой же длины а-спирального С-концевого участка. Модель апамина Хидера и Рагнарссона нельзя признать правдоподобной, поскольку она получена при многочисленных неконтролируемых или заведомо спорных допущениях. С определенностью можно сказать, что предложенная модель имеет высокую энергию, исключающую структурную самоорганизацию молекулы. Об этом свидетельствует хотя бы тот факт, что значения (p, v|/ трех остатков (Asn2, Lys4, Ala5) попадают на конформационную карту ф—\|/ в области с энергией > 10 ккал/моль. Предсказательные возможности подходов к идентификации вторичных и супер-вторичных структур, подобных использованному в работе [91], подробно обсуждаются во втором томе настоящего издания [98. Гл. 8-10].
В.Ф. Быстров и соавт. [72, 92] построили свою модель апамина, отличную от модели Р. Хидера и У. Рагнарссона [91]. Они исходили главным образом из одномерных спектров протонного ЯМР и атомных моделей Дрейдинга. Благодаря сильному перекрыванию сигналов авторам не удалось однозначно идентифицировать пики, принадлежащие остаткам Cys1 и
Cys15, Arg13 и Arg14, Gin16 и Gin17. Для остальных звеньев цепи были определены двугранные углы ср, Х\ (точнее, от одного до четырех значений для каждого из них) по эмпирическим карплюсовским зависимостям Jnh-ch =/(ф)> установленным ранее [99]. В качестве вспомогательных данных использованы pH-зависимые химические сдвиги, а также спектры |СД. На такой экспериментальной базе можно было построить множество моделей октадекапептида с двумя дисульфидными связями. Авторы [72, 92] ограничились лишь одной из этого множества, которая содержит {}-изгиб (1-5) и а-спираль (6-17). Не внесло качественных изменений в предложенную В.Ф. Быстровым и соавт. [72, 92] модель апамина привлечение Д. Уэммером и Н. Колленбахом двумерного ЯМР [81]. Скорее наоборот, использование сочетания J-корреляционных спектров с ядерны-ми спектрами Оверхаузера привело к структуре, в которой три остатка (Cys1, Pro6, Glu7) находятся в напряженном состоянии, а их конформационные точки (ф, у) на карте ф-у попадают в область высокой энергии. В значительной мере случайна также модель апамина, предложенная в работе [90]. На какой основе она была сконструирована осталось неясно; сказано лишь, что значения двугранных углов были взяты из моделей Николсона.
Молекула апамина в силу ее конформационной жесткости может считаться почти идеальной моделью для изучения трехмерной структуры с помощью физико-химических и корреляционных методов и рассматриваться как критерий их информативных возможностей. Представленные выше результаты использования экспериментальных и эмпирических подходов (табл. III. 14), по-видимому, позволяют заключить, что эти возможности в решении проблемы структурной организации относительно сложных пептидов все еще остаются весьма ограниченными. Любую из предложенных четырех моделей апамина, к построению которой были привлечены физико-химические методы и предсказательные алгоритмы, трудно отнести не только к строго доказанной, но и достаточно вероятной.
Об их неадекватности реальной конформации апамина свидетельствуют высокая энергия взаимодействия валентно-несвязанных атомов и наличие между ними существенных различий, особенно касающихся N-концевой половины аминокислотной последовательности.
10.3. ТЕРТИАПИН
Тертиапин, как и апамин, - минорный компонент пчелиного яда. Этот пептид, состоящий из 21 аминокислотного остатка (рис. П1.12), в том числе четырех остатков цистеина, образующих дисульфидные связи Cys3-Cys14 и Cys5-Cys18. Тертиапин действует главным образом на нервные клетки, изменяя скорость спонтанного высвобождения медиатора из пресинаптиче-ских окончаний, что, как полагают, обусловлено ингибированием активности регуляторного белка кальмодулина, с которым тертиапин специфически связывается. Результаты физико-химических исследований свидетельствуют о наличии у пептида компактной глобулярной структуры, стабильной в широком интервале значений pH, температуры и при изменении полярности растворителя. Важную роль в стабилизации пространственных
¦Г
iv{.
Рис. 111.12. Аминокислотная последовательность и схема конформационного анализа молекулы тертиапина
структур играет система из двух дисульфидных связей, восстановление которых приводит к денатурации молекулы.
Расчет пространственного строения тертиапина, выполненный A.JI. JIo-мизе и автором данной монографии [100], по времени следовал за расчетами апамина, брадикининпотенцирующих пептидов и ряда других объектов и учитывал накопленный опыт. Результаты предшествующих работ, в частности, показали, что большое значение в конформационном анализе сложных пептидов приобретает вопрос о рациональном способе разбиения последовательности на фрагменты, позволяющем максимально ускорить поиск пространственной структуры и получить наиболее надежные результаты. Главное, однако, заключалось не в совершенствовании методических приемов, а в получении достоверных результатов и апробации постулированных принципов. Используемый в анализе тертиапина и MCD-пептида способ разбиения последовательности на фрагменты не привел пока к быстрому решению задач, скорее наоборот. Его выбор был продиктован иными соображениями. Дело в том, что принятая в исследовании этих сложных пептидов процедура приближала к более глубокому пониманию механизма сборки природных последовательностей в нативные конформации. Авторы исходили из предположения, что метод расчета будет оптимальным в том случае, если он сможет моделировать реальный процесс самопроизвольного свертывания пептидной цепи в нативную конформацию. Для этого необходима была предварительная идентификация нуклеационных участков цепи, существование которых на коротких фрагментах (5-6 остатков) ранее было обнаружено в работах, рассмотренных выше. Рациональный способ поиска нуклеаций не известен, в связи с чем попытались выявить конформационно-жесткие участки, инициирующие укладку развернутой пептидной цепи, путем тотального изучения ближних и средних взаимодействий на всех перекрывающихся фрагментах (этап I, рис. III. 12). Можно было надеяться, что процедура отбора низкоэнергетических конформаций даст наиболее надежные результаты, так как оптимальные по энергии конформации инициирующих участков могут служить своего рода "центрами кристаллизации" и входить в неизменном виде в
