Проблема белка. Том 2: Пространственное строения белка - Попов Е.М.
ISBN 5-02-001697-7
Скачать (прямая ссылка):
19 Гонадотропин (на Человечески 28 Гетеродимер 2,6 19,9 Синхротронное излучение; ан [514]
тивный и Se-Met) й эмбрион омальная дифракция на четы
рех длинах волн Se (МАД);
температура 277, 293 и 110
К.
20 Глутамин-5-фос- Bacillus 210 Гомотетрамер 3,0 22,4 Синхротронное излучение; [515]
форибозил-1 -пиро subtilis аномальная дифракция на
фосфат амидо- трех длинах волн на атомах
трансфераза Fe в четырех [4Fe---4S] клас
терах тетрамера (МАД)
*В кристаллографии белка разрешение определяется минимальным межплоскостным расстоянием (dm), в пределах которого собраны дифракционные данные (нли р пределах которого значения фактора рассеяния F включены в расчет рядов Фурье).
**Фактор расходимости R контролирует эффективность уточнения и определяется ио формуле:
r = ?if-c- Рда'.юа 1РЭКСП
перспективу для изучения механизмов протекающих в белковых кристаллах процессов путем исследования трехмерных структур промежуточных соединений, время жизни которых продолжительно, или оно может быть пролонгировано при изменении внешних условий. Открывающиеся здесь возможности делают метод рентгеноструктурного анализа еще более уникальным. Можно с уверенностью предположить, что использование синхротронного излучения позволит непосредственно наблюдать за кинетикой конформационных и химических изменений структур белков на атомном уровне по ходу, например, ферментативных реакций. О том, что такая возможность появится в самом недалеком будущем, свидетельствуют результаты попыток последних двух лет подойти к рассмотрению динамических проблем молекулярной биологии с помощью рентгеноструктурного анализа. Есть даже работа, обсуждаемая ниже, в которой такого рода задачу пытаются решить, используя традиционный источник излучения рентгеновскую трубку.
Механизм функционирования галоалкандегалогеназы. Авторы ряда работ применили рентгеновскую кристаллографию к изучению механизма каталитического акта галоалкандегалогеназы (табл. 1.10) [503 -505]. Трехмерные структуры фермента, монокристалл которого постоянно находится в маточном растворе, были расшифрованы по картам электронной плотности, рассчитанным по дифракциям образца в отсутствие и в присутствии субстрата 1,2-дихлорэтана [504]. При pH 5 и 4°, условии, далеком от оптимального, (pH 8,2 и 22°), субстрат связывался с активным центром, однако развития каталитической реакции не происходило. Образовавшийся невалентный фермент-субстрат-ный комплекс Михаэлиса оставался стабильным как угодно долго, и поэтому его структура могла быть определена при использовании излучения рентгеновской трубки, экспозиции в 48 ч и сохранении всех других условий анализа нативного фермента. Найденное расположение субстрата в активном центре в схематической форме представлено на рис. 1.39. Один атом хлора (Clj) в комплексе располагается на расстояниях 3,6 и 3,2 А от атомов азота боковых цепей Тгр-125 и Тгр-175 и взаимодействует с водородами двух связей N-H. Другой атом хлора (С12) стабилизирован дисперсионными взаимодействиями с бензольными кольцами Phe-128 и Phe-172. В найденной конформации субстрата в активном центре атом углерода С] сближен с кислородом О®1 боковой цепи Asp-124 (3,8 А), что главным образом и обусловливает продуктивность невалентного комплекса. При нагревании кристаллического образца до комнатной температуры происходит разрыв связи Q-C1],
сопровождаемый образованием иона С1] и алкилированием кислорода О81 остатка Asp-124. Именно на такое изменение комплекса указывает расшифрованная трехмерная структура, которая возникает и остается стабильной в условиях pH 5 и 22°. Ее схема приведена на рис. 1.40. Наконец, при pH 6,2 и 22° алкилированный фермент гидролизуется молекулой воды, активированной боковыми цепями взаимодействующих друг с другом остатков His-289 и Asp-260. Продукты
148
Рис. 1.39. Схема активного центра невалентного комплекса галоалкандегалогеназы с 1,2-дихлорэтаном [504]
Рис. 1.40. Схема активного центра ацилфермента, образованного при взаимодействии галоалкандегалогеназы с 1,2-дихлорэтаном [504]
149
реакции удаляются, а фермент возвращается в исходное состояние, что и фиксирует рентгеноструктурный анализ.
