Проблема белка. Том 2: Пространственное строения белка - Попов Е.М.
ISBN 5-02-001697-7
Скачать (прямая ссылка):
358
ковых молекул. Что же касается денатурации, то предпринятое Крейтоном [59] еще в 1978 г. изучение механизма свертывания и развертывания полипептидной цепи БГТТИ и сегодня опережает аналогичные работы по другим белкам.
Аминокислотная последовательность БГТТИ из 58 остатков была установлена Б. Касселем и М. Ласковским [60]; трехмерная структура белка с разрешением 1,9 А получена Р. Хубером и соавт. [61] в 1974 г. и вскоре уточнена до 1,5 А Дж. Дайзенхофером и У. Стейгеманом [62]. Белок включает шесть остатков Cys, которые образуют три дисульфидные связи: Cys-5-Cys-55, Cys-14-Cys-38 и Cys-30-Cys-51. Схематически трехмерная модель пептидного остова молекулы БПТИ показана на рис. III.4.
Для поиска, фиксации и установления структуры промежуточных состояний, которые и определяют основные этапы пути укладки белковой цепи, исключительное значение, как уже подчеркивалось, имеют остатки цистеина, точнее, их способность обратимо и легко переходить в содержащий дисульфидную связь димерный остаток цистина.
Остатки цистеина и цистин легко переходят друг в друга по схеме:
(-HN СО-) (-HN СО-) О-) (-HN СО-)
Превращение двух сульфгидрильных, или тиольных, групп в дисульфидную представляет собой окислительно-восстановительную реакцию, чувствительную к присутствию в растворе акцептора (донора) электронов. Для кинетического изучения денатурации особенно важно то обстоятельство, что взаимодействия остатков Cys в белковой молекуле определяются не столько различиями в химических свойствах их сульфгидрильных групп (они, как правило, незначительны), сколько стереохимическими факторами и конформационными возможностями полипептидной цепи. Скорость образования S-S-связи между любой парой остатков цистеина зависит исключительно от их взаимного расположения в пространстве и, следовательно, может являться количественной характеристикой вероятности соответствующих конформационных переходов. Идентификация дисульфид ной связи ведет к обнаружению конформации, обеспечивающей ее образование. Термодинамическое условие состоит в том, что конформационное состояние белковой цепи, стабилизирующее данную дисульфидную связь, должно в той же степени быть стабилизировано наличием этой связи. Следовательно, конформационная основа механизма свертывания проявится благодаря конформациям промежуточных состояний,
12.1. ДИСУЛЬФИДНЫЕ СВЯЗИ В БЕЛКАХ
НгС—S—S—сн2
/ \
359
обнаруживаемых через дисульфидные связи, конечно, при условии, что они останутся неизменными при такой процедуре [63-66].
Способ контролируемого образования S-S-связи, основанный на реакции тиол-дисульфидного обмена, был предложен в 1970 г. В. Саксеном и Д. Уетлауфером [67]. Он связан с использованием дисульфидного реагента R2SSR2 в щелочных условиях, когда тиольная группа находится в ионной форме (R]S_) и чрезвычайно реакционноспособна:
Образование по такому механизму дисульфидной связи между боковыми цепями остатков Cys в белке происходит в две стадии по следующей схеме:
где к - константы скорости прямой (+) и обратной (-) реакций. Первая стадия реакции - обычная реакция тиол-дисульфидного обмена, лишенная какой-либо белковой специфики. Вторая же стадия целиком зависит от сближенности соответствующих остатков Cys, т.е. от конформационных возможностей белковой цепи. Кинетика суммарной реакции зависит от относительных скоростей реакций обеих стадий. При благоприятном взаимном расположении остатков Cys или в случае более быстрого их сближения по сравнению с образованием промежуточного продукта скорость синтеза дисульфидной связи ограничивается первой стадией и будет пропорциональна концентрации вводимого дисульфидного реагента. При его большой концентрации и накоплении промежуточного продукта скорость суммарной реакции лимитируется второй стадией. В случае медленного взаимодействия остатков Cys возникает конкурентная реакция с образованием ненужного продукта. Этого можно избежать, если использовать, по предложению У. Клеланда, нелинейный дисульфид, а циклический, например дитиотреитол (DTT) [68]:
R,S" + R2SSR2 RjSSR2 + r2s-.
S
I + RSH ,S
360
HOCH s s
I j (DTTh HOCH s b
\/
CH2
В восстановленной форме дитиотреитол имеет линейную структуру:
уСН2—SH
HOCH SH
I (DTT )
HOCH SH
\снг---SH
Его взаимодействия с белковой цепью описываются следующей схемой:
S
_ SH SH
где К] - константа равновесия смешанного дисульфида равна, согласно Клеланду, 1(Н моль-1. Такое значение К] при обычных концентрациях s
DTT I исключает заметное накопление этого продукта.
Скорость реакции межмолекулярного тиол-дисульфидного обмена, не отягощенного стерическими условиями, может быть оценена по
