Практикум по цитологии растений - Паушева З.П.
ISBN 5-10-000614-5
Скачать (прямая ссылка):
Для успешного проведения этой работы необходимо приготовить следующие растворы:
фуксииосернистая кислота (реактив Шиффа). Растворяют 1 г основного фуксина для фуксиносернистой кислоты (обратить внимание на сложное название фуксина!) в 200 мл кипящей воды, остужают до 50°С и прибавляют 20 мл 1 н. соляной кислоты; остужают до 25 °С и прибавляют 1 г сухого метадисульфита натрия (Na2S205). Раствор помещают в цилиндрический сосуд, оклеенный снаружи черной бумагой (кроме дна). Через сутки жидкость обесцвечивается. Чтобы определить это, сосуд ставят на белую бумагу, открывают крышку и смотрят внутрь. Иногда жидкость имеет слабо-желтый цвет;
сернистая вода. К 200 мл проточной воды прибавляют 10 мл 10%-го раствора метадисульфита натрия и 10 мл 1 н. соляной кислоты. Используют в работе только свежий раствор;
соляная кислота, 1 н. раствор. Берут одну ампулу ОД н. фик-санала соляной кислоты и доводят ее содержимое дистиллиро^ ванной водой до 100 мл. Получается 100 мл 1 н. соляной кислоты. Можно приготовить 1 н. раствор соляной кислоты и так: 82,5 мл НС1 (плотность 1,19) доводят до 1 л водой.
Наклеивать срезы на предметные стекла при этом методе иногда приходится белком. Последовательность работы следующая.
Г. Помещают предметные стекла со срезами в первый сосуд с ксилолом на 10—30 мин для удаления парафина и затем во второй—на несколько минут.
2. Обмывают стекла со срезами 96%-м раствором спирта и помещают в сосуд с таким же раствором на 10—15 мин.
3. Промывают стекла со срезами в дистиллированной воде в течение 3—5 мин.
4. Ополаскивают стекла со срезами 1 н. IiCl и помещают в
сосуд с 1 н. НС1 с температурой 60°С для гидролиза. Сосуд должен находиться на водяной бане при постоянном контроле за температурой соляной кислоты. Время гидролиза при использовании фиксатора Карнуа или 10%-го раствора формалина 8 мин. Однако обычно его устанавливают в ходе работы по максимальной интенсивности цветной реакции.
5. Предметные стекла со срезами быстро остужают в холодной 1 н НС1.
6. Помещают стекла со срезами в реактив Шиффа на 1—2 ч.
7. Переносят стекла go срезами последовательно в три сосуда с растворами сернистой воды (1, 2, 3) и держат в каждом из них по 2—5 мин.
8. Промывают стекла со срезами в проточной воде 15 мин, а затем в дистиллированной воде.
9. Подкрашивают срезы 1—2%-м водным или спиртовым раствором лихтгрюна.
10. Обмывают стекла со срезами 96%-м раствором спирта и помещают в такой же раствор на 1—2 мин.
11. Обмывают стекла со срезами 100%-м спиртом и помещают в сосуд с ним на несколько минут.
12. Помещают стекла со срезами в третий сосуд с ксилолом на 5—10 мин, а затем в четвертый — на несколько минут.
13. Заключают срезы в канадский бальзам.
На интенсивность реакции Фёльгена влияют продолжительность гидролиза и присутствие в клетке ряда веществ. Эта реакция идет медленнее при наличии солей железа, дубильных веществ и некоторых белков. Ее можно использовать для цитофотометрии ДНК в ядре клетки.
Содержание и локализацию’ нуклеиновых кислот в клетке можно определить, используя основные красители в сочетании с обработкой срезов ферментами-нуклеазами, способными разрывать связи между нуклеотидами ДНК или РНК.
Хорошими красителями для нуклеиновых кислот являются галлоцианин (или оксазин) и толуидиновый синий. Г аллоцианин с хромовыми квасцами дает соединение краплак-катион, которое с фосфатными группами нуклеиновых кислот образует соли темно-синего цвета. Чтобы исключить влияние белков, окрашивание нуклеиновых кислот нужно вести при pH 1,5—1,6.
Для приготовления красителя берут 5 г хромовых квасцов, растворяют их в 100 мл воды и добавляют 0,15 г галлоцианина. Смесь встряхивают, а затем нагревают до кипения. Длительность кипения 5 мин. После этого раствор охлаждают, фильтруют и доводят водой через фильтр до 100 мл. Краситель имеет pH 1,64. Последовательность работы следующая.
1. Депарафинированные срезы доводят до воды (см. с. 86).
2. Окрашивают срезы раствором красителя в течение двух суток при комнатной температуре.
3. Промывают срезы в воде и обезвоживают.
4. Просветляют срезы в ксилоле и заключают в бальзам.
Чтобы выявить содержание и локализацию одной из двух
кислот (ДНК или РНК), препараты перед окрашиванием обрабатывают нуклеазами. Если после обработки рибонуклеазой окраска препарата ослабляется, то это происходит вследствие удаления РНК-
ДНК и РНК можно выявить красителями метиловым зеленым и пиронином с использованием рибонуклеазы по Браше.
Для этого готовят два раствора.
Раствор 1 состоит из 17,5 мл 5%-го водного раствора пиро-нина, 10 мл 2%-го метилового зеленого и 250 мл воды. Раствор хранят в холодильнике.
Чтобы очистить метиловый зеленый от примеси метилового фиолетового,' к раствору красителя добавляют равный объем хлороформа, встряхивают смесь и оставляют на 1—2 дня для отстоя. Делительной воронкой отделяют верхний слой с метиловым зеленым от нижнего слоя. Эту процедуру повторяют несколько раз.
