Искусственные генетические системы. Том 1 - Патрушев Л.И.
Скачать (прямая ссылка):
Для проявления в полной мере биологической активности многих рекомбинантных белков требуются посттрансляционные модификации их полипептидных цепей. Оказалось, что клетки насекомых обладают способностью производить большое число таких модификаций, включая гликозилирование, фосфорилиро-вание, ацилирование остатками жирных кислот и амидирование. Рекомбинантные белки могут претерпевать в них адекватный протеолитический процессинг путем удаления сигнальных последовательностей аминокислот и переноситься в соответствующие клеточные компартменты. Были проведены интенсивные исследования механизмов N-гликозилирования в клетках насекомых, которые показали, что хотя оно и происходит, но не соответствует в полной мере таковому клеток млекопитающих.
5.2.6. Сравнение эффективности
рассмотренных систем экспрессии
Проведено сравнение эффективности рассмотренных выше систем экспрессии эукариотических рекомбинантных генов с использованием гена huLIF в качестве модели. In vivo этот белок с молекулярной массой 32-67 кДа в зависимости от источника получения синтезируется под контролем уникального гена, содержащего три экзона. Фрагмент кДНК, кодирующий зрелый процессированный huLIF, клонировали в составе трех векторов, структура которых изображена на рис. 17, a-e. Для трансфекции клеток COS и СНО использовали одну и ту же конструкцию (см. рис. 17, а). Оказалось, что все пять исследованных линий клеток обладали способностью к синтезу рекомбинантного huLIF, обладающего биологической активностью. В клетках линий СНО, Sp2/0 и MEL после проведения электрофореза продукт обнаруживали в виде отчетливой, хотя и широкой полосы. В то же время рекомбинантный белок в клетках, зараженных бакуловирусами, был представлен дискретными фракциями меньшей молекулярной массы, что указывало на его неполное гликозилирование. Рекомбинантный материал в клетках COS был представлен дисперсной фракцией с молекулярной массой 20—40 кДа, что интерпретировалось в пользу ограниченной способности этих клеток осуществлять процессинг сильно гликозилированных полипептидных цепей.
Стабильные клетки-продуценты, созданные на основе амплификации рекомбинантных генов, позволяют получать рекомбинантные продукты в более высоких титрах по сравнению с клетками, адаптированными к “быстрой” кратковременной экспрессии рекомбинантных белков (клетки MEL или COS). Для получения высокого уровня экспрессии рекомбинантных белков во всех обсуждаемых системах необходимо, прежде всего, учитывать особенности структуры белка, который должен быть синтезирован, и конструировать экспрессирующие векторы в соответствии с требованиями, предъявляемыми теми или иными клетками. В ряде случаев предварительные исследования такого рода бывает удобнее провести в бесклеточных белоксинтезирующих системах, которые позволяют иногда получать даже препаративные количества рекомбинантных белков.
5.3. Клетки с нарушенной проницаемостью внешних мембран
Группа методов, основанная на использовании клеток с искусственно нарушенной проницаемостью внешних мембран для биосинтеза белковых молекул (semi-permeabilised (SP) cell systems), по механизму действия и возможностям, которые они предоставляют исследователям, занимает промежуточное положение между системами трансляции живых клеток и бесклеточны-ми белоксинтезирующими системами [258, 259]. Такие системы позволяют реконструировать начальные этапы сборки и пост-трансляционных модификаций белковых молекул, сопряженные с их биосинтезом, а также активно влиять на эти процессы в условиях эксперимента. SP-Клетки также дают возможность активно исследовать секреторные пути белков в условиях, приближающихся к таковым живых клеток.
Для получения полупроницаемых мембран клетки животных выращивают в культуре и обрабатывают детергентом дигитони-ном, повреждающим внешнюю мембрану в мягких условиях, что, в конечном счете, позволяет выделять клетки, свободные от компонентов цитозоля, но сохраняющие основные черты своей внутренней архитектуры. В последующих опытах SP-клетки можно добавлять в бесклеточные системы трансляции мРНК (см. ниже) и наблюдать за прохождением синтезирующегося белка через внутриклеточные компартменты. Для получения SP-клеток могут быть использованы любые клеточные линии, однако, каждая из них для достижения наилучших результатов требует проведения специальных этапов оптимизации. С использованием SP-клеток так же, как и бесклеточных систем, можно легко исследовать влияние отдельных компонентов на прохождение всего моделируемого внутриклеточного процесса в условиях, максимально приближенных к нативным. Кроме того, добавление к SP-клеткам реагентов, осуществляющих поперечные сшивки, позволяет фиксировать синтезирующиеся белки в просветах эндоплазматического ретикулума, что дает новые возможности для локализации систем фолдинга и внутриклеточного транспорта белков. Поскольку получение SP-клеток допускает использование любых клеточных линий, в том числе и мутантных, с их помощью можно исследовать роль генетических факторов во всех вышеупомянутых процессах.
