Искусственные генетические системы. Том 1 - Патрушев Л.И.
Скачать (прямая ссылка):
Гетерологичные зонды. Гетерологичные олигонуклеотид-ные зонды получают на основании предположения о наличии гомологии в последовательностях у генов организмов разных биологических видов, которые выполняют аналогичные функции. При гибридизации гетерологичных зондов с ДНК исследуемой клонотеки используют более низкие температуры их отжига для того, чтобы даже при наличии нескольких неправильно спаренных оснований в гибриде он оказался достаточно стабильным для обнаружения. Понижение температуры отжига зонда значительно ниже его температуры плавления будет почти неизбежно сопровождаться получением ложноположительных результатов, т.е. гибридизацией зондов с неродственными последовательностями, которые обладают определенной гомологией с искомой. Во многих случаях этот результат не опасен, поскольку после такого предварительного отбора, круг поиска нужной последовательности существенно сужается. Проведение повторной гибридизации в других условиях среди предварительно отобранных клонов может привести к положительному результату. Ситуация становится угрожающей в том случае, если число ложноположительных клонов, выявленных на первом этапе отбора, становится слишком большим. В этом случае цена повторного скрининга может оказаться слишком высокой.
Обратная трансляция. Выбрать последовательность зонда и праймеров для ПЦР к неизвестному гену иногда оказывается возможным путем очистки небольшого количества белка, кодируемого клонируемым геном, и определения последовательности его нескольких N-концевых или С-концевых аминокислотных остатков [237, 238]. На основании этих данных с учетом вырожден-
ности генетического кода и частоты встречаемости аминокислотных остатков у исследуемого организма синтезируют олиго-нуклеотидные зонды, которые используют для гибридизации in situ, аналогично тому как было описано выше. Такой подход к определению последовательности нуклеотидов гена на основании последовательности аминокислот белка, кодируемого этим геном, получил название обратной трансляции (back (reverse) translation). При решении данной задачи, вырожденность генетического кода можно преодолеть путем синтеза вырожденных олигонуклеотидов посредством введения в каждое положение синтезируемого олигонуклеотида нескольких требуемых генетическим кодом нуклеотидов. Однако сознательное повышение вырожденности зонда уменьшает его специфичность и повышает вероятность получения ложноположительных результатов. Ситуация может быть существенно улучшена путем использования при отборе нескольких вырожденных зондов, соответствующих разным участкам клонируемого гена.
Обратная трансляция аминокислотной последовательности Met-Phe-Asn-Cys-Trp указывает на необходимость синтеза 15-звенного вырожденного олигонуклеотида со следующей первичной структурой: ATGTT(Т/С)AA(T/C)TG(T/C)TGG, в которой нуклеотиды в скобках отмечают места с неоднозначной последовательностью. Теоретически олигонуклеотид длиной в 14-15 нуклеотидов, полученный путем обратной трансляции последовательности из пяти аминокислотных остатков должен быть уникальным для геномов такого размера, как геном человека. Впрочем, это утверждение верно лишь в том случае, если геном представлен случайной последовательностью. На практике это не так. В любом большом геноме встречаются мультигенные семейства с близкой первичной структурой, и наблюдается гомология между многими последовательностями, которая отражает их зависимое друг от друга происхождение. Поэтому 15-звенный олигонуклеотид при исследовании генома человека скорее всего не окажется геноспецифическим. Однако извлечь специфическую геномную последовательность с помощью таких олигонуклеотидов можно при использовании их в качестве праймеров для ПЦР на матрице кДНК соответствующей клонотеки. В этом случае неспецифические олигонуклеотиды скорее всего не будут участвовать в образовании продукта ПЦР.
Современные методы позволяют определять аминокислотную последовательность полипептида, выделенного из пятна, которое выявляется после проведения двумерного электрофореза, а также во фракциях, получаемых с помощью аналитической ВЭЖХ или
капиллярного электрофореза. Для этих целей в настоящее время широко используется MALDI-TOF-масс-спектрометрия, основанная на лазерной десорбции и ионизации макромолекул, опосредованной матриксом (matrix assisted laser desorption ionization -MALDI) и детекторами ионов, которые позволяют определять время их полета (time of flight - TOF). В этой группе методов импульсное облучение сорбента, с которым связаны анализируемые макромолекулы приводит к их высокоэффективной фрагментации и десорбции в вакуум благодаря избирательному поглощению сорбентом энергии света. При этом время полета образовавшихся ионов в анализаторе прямо пропорционально их массе.
Использование антител для отбора клонов в экспрессирующих клонотеках. Получение клонотеки генов или кДНК с использованием экспрессирующих векторов дает ряд преимуществ в их последующем отборе. В этом случае, если 5'-концевая часть клонируемого гена находится близко от промотора вектора или его кодирующая часть соединена в одной рамке считывания с инициирующим ATG-кодоном через последовательность, кодирующую часть другого белка, например, (3-галактозидазы, то в бактериальных клетках или фаговых лизатах можно обнаружить появление специфического белкового продукта или ферментативной активности. Если же рекомбинантный белок неактивен и представляет собой лишь часть полипептидной цепи нативного фермента, его обнаруживают иммунохимическими методами. Отбор нужных клонов может проводиться и с помощью чисто генетических методов с использованием специально сконструированных векторных плазмид.
