Искусственные генетические системы. Том 1 - Патрушев Л.И.
Скачать (прямая ссылка):
шей его экспрессией, что ведет к изменению свойств организма, в геном которого вводится ген (например, создание продуцентов биологически активных веществ или трансгенных животных), а также осуществление генотерапии наследственных и приобретенных заболеваний путем искусственного замещения мутантных аллелей. Во-вторых, стало реальным конструирование новых генов путем объединения in vitro как известных, так и новых, искусственно синтезированных последовательностей нуклеотидов. Этот подход используется в белковой инженерии для исследования функциональной значимости отдельных аминокислот и доменов в полипеп-тидных цепях ферментов, а также для создания новых белков. В-третьих, в современной биотехнологии появилась возможность применять изолированные гены в составе генно-инженерных конструкций для получения пищевых продуктов и биологически активных веществ белковой природы.
Поскольку в экспериментальных условиях невозможно работать с одной копией гена, создание необходимого числа идентичных копий гена (или его частей) является первой и одной из основных задач генной инженерии. Для ее решения используют метод молекулярного клонирования [61]. Сущность метода заключается в том, что нуклеотидная последовательность, которую необходимо выделить или размножить, ковалентно встраивается в самореплицирующиеся молекулы нуклеиновой кислоты, называемые векторами. Далее такая последовательность нуклеотидов в составе вектора вводится в клетки про- или эукариотического организма, и эти гибридные клетки в селективных условиях, обеспечивающих сохранение вектора внутри клеток, выращивают на питательной среде. В результате образуется клон клеток, теоретически содержащих идентичные векторные молекулы с одной и той же вставкой чужеродной последовательности нуклеотидов. Объединение молекул клонируемой последовательности нуклеотидов и вектора является не чем иным как рекомбинацией in vitro, поэтому такие гибридные молекулы называют рекомбинантными молекулами.
В настоящее время разработаны многочисленные методы, позволяющие выделять определенные последовательности нуклеотидов из сложной смеси фрагментов хромосомной ДНК, а также осуществлять обмен между строго определенными фрагментами генов и другими последовательностями нуклеиновых кислот. Во всех этих реакциях, как правило, используются высо-коочищенные препараты нуклеиновых кислот и ферментов нуклеинового обмена, особенности использования которых будут кратко рассмотрены ниже.
Гпава 2
Выделение нуклеиновых кислот и ферменты, используемые для работы с ними
Большинство ферментов, применяемых для молекулярного клонирования нуклеиновых кислот, участвует в метаболизме нуклеиновых кислот in vivo. Это означает, что генная инженерия в своем развитии опирается на достижения исследований ферментных систем метаболизма нуклеиновых кислот и существует благодаря возможности получения таких ферментов в высокоочи-щенном состоянии. В то же время сам процесс клонирования и исследования клонированных последовательностей нуклеотидов сводится к последовательному проведению in vitro определенных ферментативных реакций с использованием очищенных ферментов и их субстратов - нуклеиновых кислот.
2.1. Основные приемы очистки нуклеиновых кислот
Генно-инженерные работы, как правило, начинаются с получения препаратов высокоочищенных нуклеиновых кислот. Критериями качества используемого метода очистки ДНК и РНК, как, впрочем, и других макромолекул клетки, является чистота конечного препарата, уровень фрагментации выделяемых молекул, общий выход, а также время, требуемое для проведения выделения нуклеиновых кислот.
2.1.1. Традиционные методы
При очистке ДНК и РНК в основном используются одни и те же приемы [62]. Различия в методах их фракционирования определяются значительно большей чувствительностью молекул РНК к гидролитическому расщеплению из-за присутствия у ри-бонуклеотидов, входящих в состав РНК, свободных 2’-ОН групп, их более низкой молекулярной массой и наличием у одноцепочечных молекул характерной (компактной) пространственной структуры. Все современные методы выделения нуклеиновых кислот состоят из трех этапов: разрушения клеток, инактивации нуклеаз и собственно очистки. Для выделения нуклеиновых кислот в нативном состоянии необходимо соблюдать, по крайней мере, две предосторожности: следует использовать мягкие условия разрушения тканей биологического объекта и инактивировать гидролитические ферменты (ДНКазы или РНКазы) до того, как
они успеют гидролизовать молекулы нуклеиновых кислот. С учетом этого ингибиторы нуклеаз вводятся в буферные растворы до разрушения клеток или тканей. В качестве ингибиторов нуклеаз используют как неспецифические денатурирующие агенты (ионные детергенты, гидроокись ртути, гуанидинхлорид, гуанидин-изотиоцианат, фенол, хлороформ и т.п.), так и специфические ингибиторы, например, ингибитор РНКазы из плаценты человека или ванадиевые комплексы рибонуклеозидов.
Работу с геномной двухцепочечной ДНК (дцДНК) (особенно с ДНК эукариотических клеток) сильно усложняют значительная молекулярная масса и высокая жесткость выделяемых молекул. Следствием этого являются большая вязкость растворов высокомолекулярной ДНК и легкость ее фрагментации в таких растворах. В связи с этим, при выделении высокомолекулярной ДНК допускается лишь мягкое перемешивание ее раствора в процессе депротеинизации (освобождения от белков). Для этого на первых этапах очистки обычно применяют протеолитические ферменты (протеиназу К из Trirachium album или проназу из Streptomyces griseus) [63], фенол и хлороформ [64]. Поскольку при освобождении от белков происходит одновременная очистка ДНК и РНК, для отделения примесей РНК используют высоко-очищенные препараты РНКаз без примесей ДНКаз (чаще всего панкреатическую РНКазу), а в случае выделения РНК - препараты ДНКаз, не загрязненных РНКазами.
