Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: Электрофорез и ультрацентрифугирование - Остерман Л.А.
Скачать (прямая ссылка):
Аналогичное фракционирование гистонов проводили в геле, полимеризованном в 0,9 М уксусной кислоте с 0,38% Тритона Х-100 и 8 М мочевиной [Newrock et al., 1978]. Здесь также преэлектрофорез вели сначала с цистамином, затем с протамином. В более поздней работе [Levy et al., 1979] для разделения гистонов использовали другую пропорцию тех же компонентов буфера геля: 7%-ная уксусная кислота+0,22% Тритона Х-100+4 М мочевины.
Электрофорез в кислой мочевине с добавкой Тритона Х-100 использовали и для очистки гистонов от примеси рибосомаль-ных белков. Тритон Х-100 плохо связывается с последними, поэтому при электрофорезе в первом направлении благодаря комплексу с Тритоном Х-100 гистоны удается отделить от рибосо-
мальных белков с близкими молекулярными массами. Гистоны мигрируют вместе с относительно более крупными белками рибосом. Во втором направлении электрофорез в пластине 1'5%-ного ПААГ в присутствии 0,1% ДДС-Na позволяет выявить различие истинных молекулярных масс этих двух типов белков. ДДС-Na вытесняет Тритон Х-100 из комплекса с белком, и относительно более низкомолекулярные гистоны уходят вперед, отделяясь от рибосомальных белков [Savic, Poccia, 1978].
Вообще, двумерный электрофорез гистонов, включающий комплексообразование с Тритоном Х-100 в одном из направлений, использовался довольно часто [Hamana, Iwai, 1976; Garrard, 1976; Franklin, Zweidler, 1977; Blankstein et al., 1977]. В последние годы описано применение в тех же целях других, сходных с Тритоном Х-100 неионных детергентов. Так, после обычного электрофореза в кислой мочевине для второго направления был использован 15%-ный ПААГ, полимеризованный в 0,8 М уксусной кислоте, содержащей 0,4% Lubrol WX (фирмы «Sigma») и 6 М мочевину [Bhatnagar, Bellve, 1978]. Гистон Н2А печени и других органов мыши при этом удалось разделить на два компонента, гистон НЗ — на три или четыре; в ряде случаев расщеплялся и гистон Н1. В другой работе [Allis et al., 1979] был использован Тритон DF-16. В 12%-ном ПААГ, полимеризо-ванном в 5%-ной уксусной кислоте с 0,4% Тритона DF-16 и 6 М мочевиной, гистоны мигрируют в следующем порядке: Н4, Н1 + -I-H2B, НЗ и Н2А. Электрофорез по размерам во втором направлении (система Лэммли) разделяет их очень хорошо.
Цетавлон
Цетилтриметиламмонийбромид (цетавлон) — положительно заряженный ионный детергент. Как известно, ДДС-Na растворяет не все щелочные белки, зато хорошо растворяет нуклеиновые кислоты, которые могут создавать помехи при электрофорезе белков, входящих в состав нуклеопротеидов. Паним и соавторы предложили заменить ДДС-Na на цетавлон [Panyim et al., 1977]. Как и ДДС-Na, цетавлон способствует растворению белков за счет связывания с гидрофобными участками полипептидов. Благодаря электростатическому отталкиванию положительно заряженных аммониевых групп цетавлона белковые цепи распрямляются и приобретают жесткость. Комплекс белка с цетав-лоном, особенно в кислой среде, заряжен заведомо положительно. Вместе с тем цетавлон взаимодействует с нуклеиновыми кислотами как «жирный катион» и осаждает их из раствора.
Использование цетавлона имеет и свои трудности. При взаимодействии с персульфатом аммония он довольно легко выпадает в осадок, поэтому полимеризацию геля приходится вести при слегка повышенной температуре (37е), в термостате. Кроме то-гр, цетавлон осаждает красители типа СВВ R-250, поэтому окрашивание геля ведут при температуре 80—100°.
Паним и соавторы для разделения смеси стандартных белков использовали 10%-ный ПААГ (С—1,5)» полимеризованный в 0,09 М Na-ацетатном буфере (pH 4,6) с 0,09% детавлона. Примерно таким же буфером заполняли электродные резервуары. Исходный препарат готовили, растворяя белки до концентрации 0,25—0,5 мг/мл в 0,01 М Na-ацетатном буфере (pH 4,6) с 0,5% цетавлона и 1% Р-меркаптоэтанола. Назначение последнего — такое же, как при обработке белков ДДС-Na. Белковый раствор кипятили 5 мин или инкубировали 2 ч при 37°, а затем добавляли мочевину до концентрации 6 М. На трубку (10X0,6 см) вносили 20 мкл раствора препарата (5—10 мкг белка). Электрофорез вели при силе тока 8—10 мА на гель и напряженности поля 8—10 В/см"/ В качестве лидирующего красителя использовали 0,05%-ный раствор Azure А. Белки окрашивали 0,25%-ным раствором СВВ R-250 в 1Й%-ной уксусной кислоте, содержащей 45% метанола, в течение 30—60 мин при температуре 80—100°. Отмывали излишек- красителя в 0,9 М уксусной кислоте при той же температуре.
Как и при электрофорезе с ДДС-Na, в случае обработки це-тавлоном также наблюдается линейная зависимость между логарифмом молекулярной массы белка и расстоянием его миграции в геле. Пользуясь этой зависимостью, удается оценивать молекулярные массы белков в интервале 15—90 тыс. дальтон.
Эли и соавторы недавно предложили модификацию описанной выше системы [Ely et al., 1979]. Они заменили персульфат аммония на флавинмононуклеотид (ФМН) в качестве инициатора полимеризации, которая идет при освещении (ФМН растворим лучше, чем рибофлавин). Это снимает проблему осаждения цетавлона при полимеризации геля.
