Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: Электрофорез и ультрацентрифугирование - Остерман Л.А.
Скачать (прямая ссылка):
Рассмотрим для примера щелочную систему Орнстейна и Дэвиса (рис. 21). Верхним буфером служит 0,005 М Трис, титрованный добавлением глицина до pH 8,3. Глицин по отношению к Трису выступает в роли слабой кислоты. Для достижения pH 8,3 концентрацию глицина приходится довести до 0,038 М При pH 8,3, как мы видели, значительная доля его молекул должна быть заряжена отрицательно, что обеспечивает хорошую электропроводность верхнего электродного буфера.
Крупнопористый формирующий гель полимеризуют в 0,0625 М Трис-НС1, pH 6,8. В таком же буфере вносят> и препарат (с добавкой, как обычно, до 10% глицерина или сахарозы). Первоначально электропроводность этого буфера будет тоже высокой благодаря ионам С1-. Их концентрация при pH 6,8 достаточно высока (см. выше).
Наконец, рабочий гель полимеризуют в 0,375 М Трис-НС1, pH 8,9. Обращает на себя внимание высокая концентрация бу-
Рнс. 21. Схема ступенчатого электрофореза
А — перед включением напряжения; ? — момент концентрирования препарата в тонкую исходную полоску; В — фракционирование белковых зон
(
фера, необходимая по двум причинам. Во-первых, при pH 8,9 буферная емкость Трис-HCl уже мала, а в этом буфере должны мигрировать сконцентрированные белковые полосы. Во-вторых, относительное содержание ионов С1~ при таком значении pH невелико, и для обеспечения необходимой электропроводности концентрацию буфера приходится увеличивать. Нижний электродный буфер существенной роли не играет. Например, можно взять 0,1 М Трис-HCl, pH 8,1.
Теперь рассмотрим процессы, протекающие в этой системе ¦после включения электрического напряжения. В первый момент напряженность поля будет примерно одинаковой во всех ступенях системы и начнется переход белков из буфера препарата в формирующий гель. В это же время в верхней части формирующего геля начнет развиваться новая ситуация. Под действием поля ионы С1_ будут быстро уходить в направлении рабочего геля, а на их место из электродного буфера будут поступать ионы глицина. Но здесь они окажутся в буфере с pH 6,8. При этом, как следует из изложенного, большинство молекул глицина восстановит заряд своих аминогрупп, нейтрализуется и перестанет участвовать в проведении тока. Сопротивление буфера препарата, а за ним и верхней части формирующего геля резко возрастет. Вместе с ним возрастет и напряженность поля. Не-
многочисленные при pH 6,8 заряженные молекулы глицина ускорят свое движение к аноду, обеспечивая непрерывность электрического тока по всему гелю.
Неправильно представлять себе дело так, что только малое число молекул глицина будет мигрировать в поле, а остальные останутся на месте. Состояние диссоциации-ассоциации аминогрупп— это статистическое равновесие, захватывающее всю совокупность молекул глицина, находящихся в растворе. Поэтому все они (рывками) будут мигрировать в направлении анода, но. в каждое мгновение электрический заряд будет переносить лишь небольшое число молекул, заряженных именно в это мгновение. Но вернемся к событиям, развивающимся в геле.
Мы видели,, что в верхней части формирующего геля возникает область повышенной напряженности поля, в которой оказываются и успевшие перейти в гель белки. Естественно, что они мигрируют в ней относительно быстро. Так же быстро идет переход белков из буфера препарата в формирующий гель. Впрочем, белки мигрируют все же медленнее, чем ионы глицина, так как отношение заряда к массе у белков меньше. Описанные явления постепенно распространяются на весь формирующий гель. Ионы хлора, отступая, очищают весь объем этого геля. Вплотную за ними к границе с рабочим гелем подходит глицин. Теперь весь формирующий гель находится в зоне повышенной напряженности поля. В этом поле ускоренно движутся белки, уже перешедшие из исходного раствора препарата в формирующий гель. Никакого их концентрирования пока не происходит; оно начнется лишь тогда, когда впереди идущие молекулы белка достигнут границы рабочего геля. Тем временем линия раздела ионов хлора и глицина уйдет уже в рабочий гель, где замена одних ионов на другие не вызовет увеличения напряженности поля. Дело в том, что здесь молекулы глицина оказываются при pH 8,9, который обеспечивается степенью ионизации и высокой концентрацией Триса. При этом pH большая часть нейтральных молекул глицина снова превращается в ионы. Эти нейтральные молекулы оказались в рабочем геле в силу статистического характера миграции глицина, который был описан выше. Электропроводность Трис-глицинового буфера в верхней части рабочего геля оказывается столь же высокой, как и Трис-HCl (этого добились подбором pH 8,9 и концентрации всех компонентов системы). Напряженность электрического поля в рабочем геле соответственно остается низкой, и это обстоятельство играет решающую роль в концентрировании белков.
Впереди идущие молекулы белков достигают границы раздела и переходят в. рабочий гель, где попадают в область низ*, кой напряженности поля. Скорость их миграции резко падает. Между тем следующие за ними молекулы белка еще движутся в объеме формирующего геля, т. е. в области высокой напряженности поля, и движутся' быстро. Потом и они входят в рабочий гель и почти останавливаются. Это происходит со всеми моле-
