Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: Электрофорез и ультрацентрифугирование - Остерман Л.А.
Скачать (прямая ссылка):
Еще раз подчеркнем, что электропроводность любого буфера определяется не только концентрацией, но степенью и характером его ионизации (близостью pH к рК„ буфера и подвижностью образующих ионов). Концентрации рабочих буферов в пределах 0,05—0,1 М можно считать ориентировочно нормальными, хотя для слабо ионизированных буферов, используемых вблизи границы их буферной области, можно встретить в литературе и более высокие значения концентрации — вплоть до 0,4 М.
В непрерывной системе сопротивление геля не должно заметным образом изменяться в процессе электрофореза. Как следствие этого, не должна изменяться и расходуемая мощность. Повышение напряжения источника, работающего в режиме постоянного тока, или уменьшение силы тока при постоянном напряжении говорят о каких-то неполадках в электрической цепи, например: о высыхании фитилей или нарушении контактов между ними и гелем.
Использование мочевины
Уже указывалось, что для предотвращения агрегации белков в рабочий буфер геля нередко вводят мочевину в концентрации от 2 до 8 М. Ее, разумеется, добавляют и в исходный белковый npenapiaT. В электродные буферы вносить мочевину не нужно, так как, не будучи заряженной, она не мигрирует в геле, а следовательно, и не нуждается в пополнении. На электропроводности буфера присутствие мочевины практически не сказывается. Ьднако под влиянием нового окружения могут изменяться р/С отдельных групп и суммарный заряд белка. Это может заметно повлиять на конфигурацию, а следовательно, и на подвижность белков.
В концентрированных ^растворах мочевины происходит денатурация белков, часть дисул'ьфидных мостиков рвется и полипеп-тидная цепочка, утратив вторичную структуру, ведет себя как хаотический клубок. Денатурация не является полной и может быть обращена. Степень и обратимость денатурации зависят от природы белка и концентрации мочевины, поэтому при выборе этой концентрации иногда приходится искать компромисс между опасностью агрегации белков и угрозой их необратимой денатурации. Об очистке мочевины было сказано выше; добавим только, что образование цианата в растворах мочевины идет ускоренно при щелочных pH, поэтому щелочные буферы с'добавкой мочевины следует использовать сразу после их приготовления.
Для составления геля пользуются обычно «маточными» растворами повышенной концентрации. Удобно, например, приготовить 40%-ный водный раствор смеси мономеров (7’=40). Напомним, что Т выражает процентное отношение массы обоих мономеров к конечному объему их раствора, а С — отношение массы NN'-метиленбисакриламида к сумме масс двух мономеров. Отсюда следует, что С не изменяется при разбавлении маточного раствора. Так, если предполагается иметь для рабочего геля параметры Г=Ю и ?*=2,6, то при составлении маточного раствора можно взять 7=40 и С=2,6. Практически это означает, что надо отвесить (40x2,6)/100= 1,04 г метиленбисакрилами-да и 40—1,04 = 38,96 г акриламида и растворить их в воде до конечного объема 100 мл. Маточный раствор буфера может иметь двух- или пятикратную концентрацию. В последнем случае полезно проверить, что pH буфера сохраняется при соответствующем разбавлении. Смесь расчетных объемов маточных растворов мономеров и буфера доводят до нужного объема водой.
Персульфат аммония лучше добавлять в минимальном объеме, который можно не учитывать. Для этого готовят концентрированный, обычно 10%-ный, маточный раствор персульфата, остатки которого вскоре приходится выбрасывать, так как он не хранится. Объемом вносимого в смесь ТЕМЕД также всегда можно пренебрегать.- Выбор содержания персульфата аммония и ТЕМЕД, порядок их внесения в раствор мономеров, необходимость деаэрации и контроль за процессом полимеризации геля были подробно рассмотрены в главе 1.
Для приготовления геля с высоким содержанием мочевины ее добавляют во все маточные растворы. При растворении мономеров до Т=40 концентрацию мочевины приходится ограничивать значением 2—3 М. Зато маточный раствор буфера можно приготовить на 10 М мочевине и такой же концентрации раствор ее использовать для доведения до расчетного объема вместо воды.
Особо .гидрофобные белки, например тяжелые цепи миозина, при концентрировании их в полосах агрегируют даже в присутствии 8 М мочевины. Во избежание этого их можно обработать
фенолом, который играет роль мягкого детергента. Белок сначала растворяют в буфере до безопасной концентрации, а потом переводят в смесь, состоящую из 50% фенола, 25% уксусной кислоты, мочевины до концентрации 2 М и воды. Электрофорез проводят в ПААГ, полимеризованном в 35%-ной уксусной кислоте с 5 М мочевины [d’Abbis et al., 1979].
В некоторых случаях бывает необходимо при электрофорезе сохранить ферментативную активность белка — либо для последующей его элюции и использования, либо для обнаружения с помощью биологического теста, т. е. по превращению субстрата ферментативной реакции (см. ниже). Использование в этом случае концентрированного раствора мочевины является нежелательным, и уменьшать опасность агрегации приходится за счет снижения загрузки геля. Чувствительность биологических тестов зачастую позволяет это сделать. Необходимо точно проверить устойчивость фермента при выбранной величине pH рабочего буфера. При этом следует иметь в виду, что истинная величина pH в геле примерно на 0,5 ед. больше, чем у используемого щелочного буфера, и на 0,5 меньше, чем у кислого [Shuster, 1971].
