Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: Электрофорез и ультрацентрифугирование - Остерман Л.А.
Скачать (прямая ссылка):
^ __ 1 / гмако гмакс гмин ^мин
г0-у - .
Отметим, что положение этой точки не зависит ни от природы и концентрации соли, ни от скорости вращения ротора.
Отсчитывая от этой точки, можно найти плотность рг в любой точке градиента г из очевидной зависимости: рг=Ро+ + ю2(г2 — и1)/2%. Это выражение выведено для бакет-роторов. Как будет показано далее, равновесное центрифугирование целесообразнее вести в угловых роторах, но и для них в первом приближении данная зависимость может быть использована.
Для бакет-роторов SW41 и SW65 недавно опубликованы таблицы и графики для выбора начальной плотности растворов CsCl, обеспечивающей получение желаемой плотности у дна пробирки при равновесии, в зависимости от скорости вращения ротора при температуре 25° [Reicn, Zarybnicky, 1979].
Следует иметь в виду, что профиль равновесного градиента плотности сохраняется только во время вращения ротора при расчетном числе оборотов. При замедлении вращения перед остановкой ротора диффузия уже не уравновешивается центробежными силами. Это особенно проявляется у обоих концов градиента, в то время как в средней его части наблюдается определенная компенсация: диффузия соли из какого-либо
среднего слоя в сторону мениска пополняется диффузией в него из соседнего слоя со стороны дна пробирки. Практически в срединных трех четвертях длины градиента форма его сохраняется вплоть до полной остановки ротора. Именно здесь, а не вблизи краев градиента, должны располагаться зоны фракционируемых частиц. Само собой разумеется, что «раскапывать» равновесный градиент надо немедленно по окончании центрифугирования.
Аналогично происходит и образование градиента плотности. Изменения начинаются также с его концов, где нет компенсации, но уже не диффузии, а оседания частиц. Постепенно эти изменения захватывают всю длину градиента, как показано на
серии рисунков (рис. 63). Отсюда следует, что протяженность градиента (длина пробирки) должна сильно влиять на время, необходимое для достижения равновесия. Теория показывает, что это время (/) с точностью до 1 % от идеального может быть найдено из соотношения t=k(rlimK — гмив)2. Коэффициент пропорциональности k зависит от вязкости среды, температуры и природы соли. Для растворов CsCl А:=5,6. Если радиусы выражены в сантиметрах, то t получается в часах.
Чтобы оценить порядок значений t, подсчитаем его, например, для бакет-ро-тора SW50.1, пробирки которого длиной 51 мм целиком заполнены раствором CsCl. Из данных ротора имеем: гмакс=
= 10,7 см, Гмин= 6 см. Подставив эти значения в приведенную формулу, получим ^ == 120 ч. Аналогично для ротора SW41Ti можно найти /=400 ч. Однако эти значения очень велики и не соответствуют известной практике, когда равновесное центрифугирование проводят за 40—60 ч.
Здесь нет противоречия, так как равновесное центрифугирование, как будет видно ниже, ведут или в угловых роторах (где длина градиента намного меньше), или при неполном заполнении пробирок бакет-ротора, или же фактически далеко от равновесного режима (отчего иной раз и получают плохое разрешение полос).
Следует отметить, что время установления равновесного градиента не зависит от скорости вращения ротора. На первый взгляд, это кажется парадоксальным. Казалось бы, что при большей скорости вращения равновесный градиент должен был бы образоваться скорее. Но вспомним, что при большрй скорости и различие плотностей на концах градиента (Др) должно быть больше, т. е. процесс расслоения исходного однородного раствора соли должен пройти дальше, чем при малой скорости.
Есть еще один важный фактор, определяющий выбор продолжительности центрифугирования. Речь идет о времени, необходимом для миграции молекул вещества к положению равновесия из всего объема градиента, т. е. о времени формирования полос. При этом в расчетах следует исходить из наихудшей ситуации, т. е. убедиться, что продолжительность центрифугирования достаточна для миграции наиболее мелких молекул (с минимальным значением sao,w) от мениска (или от дна) до их положения равновесия. Точная формула для подсчета времени миграции (/„) выглядит следующим образом;
t=0
Рис. 63. Кинетика установления равновесного распределения плотности при длительном ультрацентрифугировании концентрированного раствора хлористого цезия
Здесь р, и г,—соответственно плавучая плотность и равновесная координата на градиенте частиц с интересующей нас константой седиментации s2o,wi; N — частота вращения ротора-, тыс. об/мин; /„ — время миграции, г.
Время миграции, в отличие от времени установления гради-. ента, очень сильно зависит от частоты вращения ротора. И если положение частицы на градиенте при равновесии не зависит от ее размеров, то время достижения этого положения тем больше, чем меньше размер частицы. Последнее обстоятельство является решающим.
В выражении для tM явным образом не фигурирует длина градиента (пробирки). Но чем она больше, тем больше различаются значение плотности градиента у мениска и плавучая плотНость частицы и, следовательно, тем больше начальная скорость ее движения по градиенту.
