Радиационная биофизика (ионизирующие излучения) - Кудряшов Ю.Б.
ISBN 5-9221-0388-1
Скачать (прямая ссылка):
Однако в облученных бактериях происходила не обычная репликация, протекающая только в репликационных вилках с образованием меченых бромурацилом протяженных участков полинуклеотидов, а репарационная, сопровождающаяся включением бромурацила во многих рассеянных по разным участкам ДНК точках. Об этом говорило измерение плотности ДНК при равновесном центрифугировании в растворе CsCl. Бромурацил плотнее тимина, поэтому при обычной репликации возникала бы «тяжелая» нить ДНК. Однако ее образования опыты не показали. Весь бромурацил содержался в «легких» цепях ДНК.
Следовательно, его включение происходило в короткие папину-клеотидные участки, окруженные длинными нереплицировавшимися полинуклеотидными последовательностями, так что плотность ДНК заметно не изменилась.
6. Повреждения и процессы восстановления ДНК
257
В дальнейшем были изучены ферментные механизмы рассматриваемого типа репарации ДНК. Согласно схеме, предложенной Говард-Фландерсом, одна или несколько молекул фермента, кодируемого генами uvr А и uvr В, постоянно «обегает» кольцевой бактериальный геном, «выискивая» в двойной спирали ДНК структурные нарушения. Когда такой фермент сталкивается с повреждениями ДНК, обусловленными появлением тиминовых димеров, он вызывает два разрыва в полинуклеотидной цепи по обе стороны от фотохимического повреждения. В результате происходит эксцизия тиминового димера вместе с несколькими соседними нуклеотидами.
Другой вариант состоит в том, что фермент вызывает лишь один разрыв с 5'-стороны повреждения, что позволяет ДНК-полимеразе I вырезать поврежденный участок под действием своей 5', З'-экзонукле-азной активности. Образующаяся брешь заполняется под действием репарирующей активности той же ДНК-полимеразы I, прибавляющей нуклеотиды к З'-ОН-концу старой полинуклеотидной цепи, используя в качестве матрицы неповрежденную комплементарную цепь ДНК, в которой нет УФ повреждений.
Завершается процесс восстановления двойной спирали образованием с помощью ДНК-лигазы фосфодиэфирной связи между З'-ОН-концом последнего нуклеотида, включенного при репарационной репликации, и 5'-концом старой полинуклеотидной цепи.
Помимо рассмотренного механизма репарации ДНК, названного «выщепление-замещение», у бактерий обнаружен и принципиально иной путь репарации ДНК от УФ повреждений. В 1950 г. Дулбекко наблюдал резкое возрастание способности клеток Е. coli репариро-вать Т-четные фаги от повреждения, если зараженные этим фагом бактерии после УФ облучения осветить сильной вспышкой видимого света. Оказалось, что у Е. coli имеется фотореактивирующий фермент, детерминируемый геном phr. Этот фермент при воздействии светом с длиной волны 300-500 нм осуществляет прямое превращение тиминовых димеров в нормальные основания без эксцизии.
Еще один механизм репарации ДНК от УФ повреждений был расшифрован с помощью Лес" -мутантов Е. coli, открытых Кларком в 1965 г. Эти мутанты обладали способностью к эксцизионной репарации тиминовых димеров и тем не менее оказались необыкновенно чувствительными к УФ облучению. Помимо высокой чувствительности к УФ радиации, Rcc~-мутанты неспособны к генетической рекомбинации ни при конъюгации, ни при трансдукции.
Связь между репарацией поврежденной ДНК и генетической рекомбинацией была установлена в работах Говард-Фландерса, доказавшего, что, кроме механизма «вьпцепления-замещения», в бактериальной клетке существуют возможности исправления дефектов в дочерней ДНК, образующейся при репликации нерепарированной облученной родительской ДНК. Первая после облучения копия ДНК образуется в форме полинуклеотидной цепи с разрывами. Брешь возникает в дочерней цепи напротив тиминового димера матричной родительской цепи в результате препятствия для продвижения ДНК-полимеразы.
9 Ю-Б. Кудряшов
258
Гл. VI. Реакции клетки на действие ионизирующих излучений
Однако всего через 1 час после синтеза таких разорванных цепей в клетке обнаруживаются непрерывные цепи ДНК нормальной длины. Бреши заполняются в результате пострепликативной репарации, осуществляемой за счет генетической рекомбинации между комплементарными сестринскими нитями, несущими разрывы. Из этого следует, что как отсутствие способности к генетической рекомбинации, так и высокая чувствительность к УФ излучению у мутантов Rec~ обусловлены дефектом системы, отвечающей за рекомбинационные события.
По-видимому, все возможные пути репарации бактериальной ДНК от УФ повреждений исчерпываются процессами, контролируемыми генами uvr, гес и фотореактивацией. В отсутствие видимого света двойные мутанты по генам uvr и гес погибают в результате возникновения в их геноме всего одного тиминового димера.
Расшифровка молекулярных механизмов репарации бактериальной ДНК от УФ повреждений существенно расширила представления о функционировании генома и показала, что в клетке существуют генетически детерминированные системы ферментов, поддерживающие целостность генетической информации и исправляющие ее в случае нарушений.
В дальнейшем было доказано, что в общих чертах сходная система существует в клетках млекопитающих. Благодаря активности репара-тивной системы, клетки способны поддерживать целостность генома в случае повреждений, наносимых не только УФ излучением, но и ионизирующей радиацией, канцерогенами и мутагенами. В последнюю четверть века были проведены интенсивные исследования механизмов репарации ДНК от повреждений, вызванных ионизирующей радиацией. Эти работы вызвали большой интерес не только среди радиобиологов, но и среди генетиков, молекулярных биологов, биохимиков. Накоплен обширный экспериментальный материал, зачастую противоречивый и нуждающийся в дальнейшем уточнении.
