Культура животных клеток - Конки Д.
ISBN 5-03-000359-2
Скачать (прямая ссылка):
3.4. Выбор среды
Выбор среды, к сожалению, часто происходит чисто эмпирически и диктуется, в частности, тем, какую среду использовали в вашей лаборатории для работы с другими клетками или ка-
2—437
кую среду использовали ранее другие исследователи для работы с клетками, аналогичными вашим. Это не столь важно для постоянных линий клеток, но при работе со специализированными клетками, с первичными культурами, при выращивании клеток в отсутствие сыворотки выбор среды может иметь принципиальное значение. Более подробно эта проблема будет рассмотрена в гл. 2.
Использование более сложных сред в отсутствие сыворотки обеспечивает два преимущества: такие среды могут быть селективными для определенного типа клеток, а отсутствие сыворотки облегчает выделение из среды требуемых продуктов клеточного метаболизма.
Тем не менее культивирование в присутствии сыворотки проще и, как ни странно, часто оказывается не более дорогим, хотя, конечно, менее контролируемо. Две главные причины все еще ограничивают применение бессывороточных сред: а) очень медленно растет выпуск коммерческих ингредиентов таких сред (не многие исследователи способны изготовлять среды собственными силами) и б) потребности в бессывороточной среде в большей степени зависят от типа используемых клеток. Сыворотка нивелирует многие недостатки среды, которые могут проявляться в ее отсутствие. Проблема может стать особенно острой при культивировании опухолевых клеток; клеточные линии, происходящие из разных опухолей, могут требовать модификации культуральной среды.
В конце концов выбор среды все еще остается эмпирическим. Просмотрите литературу и выясните, какая среда использовалась ранее. Если использовалось несколько различных сред (как это чаще всего и бывает), проверьте все эти среды, а также некоторые другие по вашему выбору. Оцените рост культуры (время генерации и плотность насыщения) (см. ниже), эффективность клонирования (гл. 8), экспрессию специфических свойств (дифференцировка, размножение вируса, выход клеточного продукта и т. д.). Выбор среды может оказаться неодинаковым по этим параметрам: так, например, дифференцировка легочного эпителия лучше проходит в присутствии сыворотки, а размножение этих клеток — в отсутствие сыворотки. Если возможно, используйте в своей работе одну или несколько бессывороточных сред с добавлением в случае необходимости факторов роста, гормонов и микроэлементов (см. гл. ,2).
Остановившись на каком-то одном типе среды, старайтесь как можно дольше его не менять. Аналогично при использовании сыворотки постарайтесь обеспечить себя сывороткой одной партии на 0,5—1 год работы, прежде чем заменить ее на предварительно опробованную сыворотку другой партии.
3.5. Газовая фаза
Состав газовой фазы определяется тремя факторами: а) типом среды, б) использованием открытых (чашки Петри, многолуночные чашки) или закупоренных (флаконы, бутыли) культуральных сосудов и в) требуемой буферной емкостью. Некоторые параметры культивирования могут варьировать, но должны соблюдаться одно главное правило и три основных условия. Правило заключается в том, что концентрация бикарбоната и парциальное давление СОг должны находиться в равновесии. Три основные условия можно суммировать следующим образом:
НС03
1. Низкая буферная емкость, 4 мМ герметично закрытые флаконы
2. Умеренная буферная ем- 23 мМ кость, открытые или герметично закрытые флаконы
3. Высокая буферная емкость, 8 мМ открытые нли герметично закрытые флаконы
Следует помнить, что отношение СО2/НСО3 существенно для большинства клеток, так что ни флаконы, ни чашки не могут быть использованы без наличия СОг в атмосфере.
Доведите pH среды до 7,1—7,2 при комнатной температуре и проинкубируйте в ней клетки в неглубокой чашке в течение 30 мин при нужном парциальном давлении СОг. Убедитесь, что pH среды стабилизировался при значении 7,4. В случае необходимости подведите pH с помощью стерильных 1 N НС1 или
1 N NaOH.
Парциальное давление кислорода обычно поддерживается на атмосферном уровне. Известны, однако, исключения: повышение концентрации Ог в газовой фазе органных культур (см. гл. 7) и снижение концентрации при клонировании меланомы (см. гл. 8).
3.6. Субстрет
Природа субстрата определяется главным образом типом используемых клеток и характером проводимых исследований. Почти повсеместное распространение получил в настоящее время полистирол, обработанный таким образом, чтобы увеличить смачиваемость и придать поверхности отрицательный заряд. В особых случаях (культуры нейронов, мышечных клеток и некоторые культуры эпителиальных клеток) пластиковая поверхность покрывается желатином, коллагеном или полилизи*
Газовая фаза HEPES
Воздух ¦—
5% СОг —
2% С02 20 мМ
ном для придания ей положительного заряда. Может быть использована и стеклянная посуда, но она должна быть тщательно вымыта с применением нетоксичных детергентов (см. ниже).
