Регуляция ферментативной активности - Коэн Ф.
Скачать (прямая ссылка):
Рис. 5.2. Расположение субъединиц в глутамин-синтетатезе Е. coli [3, 5].
связывается с ферментом на определенном участке; все ингибиторы могут связываться одновременно; связывание одного ингибитора не влияет на связывание других ингибиторов. Эти представления подтвердились при прямом исследовании связывания АМР и триптофана [4]; было показано, что глутамиисинтетаза может присоединить 12 молекул каждого ингибитора-регулятора. Эти данные вполне соответствуют структуре фермента, который построен из 12 идентичных субъединиц (Мг=50 000), упакованных в виде двух гексагональных колец, расположенных одно над другим (рис. 5.2). Несмотря на относительно небольшой размер субъединицы, она имеет значительное число различных участков связывания.
Для того чтобы кумулятивное ингибирование было эффективным, необходимо (по аналогии с ингибированием аспартаткиназы) наличие дополнительного регуляторного механизма, действующего на первую реакцию каждой ветви метаболического пути; регулятором при этом должен выступать ее конечный продукт. Такие механизмы обнаружены во многих системах (гл. 2).
5.1.2. Аденилирование глутаминсинтетазы
В середине 60-х годов почти одновременно в двух лабораториях были получены данные, свидетельствующие о существовании еще одного механизма регуляции активности глутаминсинтетазы. В ФРГX. Хольцер [6] обнаружил, что при выращивании Е. coli на среде, в которой источником азота служит не NH|, а другие соединения, в 'клетках наблюдается высокий уровень глу-
таминсинтетазной активности. Добавление в ростовую среду солей NH*- вызывает быстрое (в течение минуты) десятикратное снижение активности фермента, которое нельзя объяснить подавлением его синтеза, поскольку период генерации клеток — 50 мин. Следовательно, NH стимулировал инактивацию уже имевшихся молекул глутаминсинтетазы. Эффект специфичен для NH^, хотя в условиях in vitro NH4 служит для фермента субстратом, а не ингибитором. Попытки объяснить данное явление привели к открытию фермента, катализирующего инактивацию глутаминсинтетазы in vitro в присутствии АТР, Mg2+ и глутамина. В связи с этим была выдвинута гипотеза, согласно которой NH* увеличивает внутриклеточную концентрацию глутамина за счет синтеза этого соединения из а-кетоглутарата и глутамата (рис. 5.1); образовавшийся глутамин активирует фермент, инактивирующий глутаминсинтетазу.
В это же время Э. Стэдтман в США обнаружил, что препараты глутаминсинтетазы, выделенные из клеток Е. coli, выращенных в разных условиях, различаются по удельной активности, по специфичности к ионам двухвалентных металлов (Ме2+), а также по эффективности ответной реакции на ингибиторы, действующие по типу обратной связи [3, 4, 7]. Далее было установлено, что разные формы фермента содержат различные количества ковалентно связанной АМР. Стало ясно, что обе группы исследователей изучают один и тот же эффект и что инактивирующий белок Хольцера представляет собой аденилилтрансферазу (АТазу), катализирующую ковалентное присоединение АМР к определенной тирозильной группе в каждой из 12 субъединиц глутаминсинтетазы (рис. 5.3) [8—10]:
Mg2+
Е0 + 12АТР------------->- Е12 + 12PPi (5.1)
Деаденнлированная Аденнлнрованная
глутаминсинтетаза глутамин сннтета за
При превращении полностью деаденилированной глутаминсинтетазы (Е<>) в полностью аденилирован-ную (Е12) фермент переходит из активной Mg2+-3aBH-
Asn - Leu - Туг - Asp - Leu - Pro — Pro — Glu -
О — P — Аденозин
Рис. 5,3. Аминокислотная последовательность в участке аденнли-ровании глутаминсинтетазы [11].
симой формы, имеющей оптимум pH 7,6, в менее активную Мп2+-зависимую форму с оптимумом активности при pH 6,5 [4]. Мд2+-зависимый Е0-фермент ингибируется аланином, глицином и АМР, в то время как Мп^-зависимый Е^-фермент ингибируется преимущественно гистидином, триптофаном и СТР [7].
По-видимому, при функционировании глутаминсинтетазы, как и в случае других ферментов, катализирующих реакции с участием АТР, Mg2+ и Мп2+ образуют Mg2+ — ATP- и Мп2+ — ATP-комплексы; об этом свидетельствует тот факт, что для достижения оптимальной активности требуются равные концентрации Ме2+ и АТР. Известно, что Е. coli хорошо растет на синтетических средах без добавления Мп2+ и внутриклеточные концентрации Мп2+ измеряются в мкМ, в то время как концентрации Mg2+ и АТР имеют порядок мМ; следовательно, физиологическое значение имеет только активность Mg2+-3aBHCHMofl формы. Таким образом, превращение Е0 в Е12 следует рассматривать как трансформацию активной формы, чувствительной к ингибированию аланииом, глицином и АМР, в неактивную форму фермента.
Однако это превращение происходит только в экстремальных условиях, например когда клетки, выращенные в условиях недостатка NHJ', попадают в среду, богатую этим соединением. Обычно глутаминсинтета-за находится в промежуточных состояниях аденилиро-вания. Это наводит на мысль о возможном существовании гибридных молекул, в которых аденилирован-ными являются лишь некоторые из 12 субъединиц.
