Антитела. Методы. Книга 1 - Кэтти Д.
ISBN 5-03-002363-1
Скачать (прямая ссылка):
прекрасно сохраняют жизнеспособность в среде H-RPMI - 2% СПК на холоду.
Это обеспечивает . да более удобное последовательное приготовление двух
селезенок. Иногда можно столкнуться с патологически измененной
селезенкой, содержащей избыточное количество "слеток гранулоцитарного или
моноцитарнопо ряда, что может быть причиной неудачной гибридизации.
Моноклональные антитела мыши
133
3. Ореда RPMI-1640, используемая для промывания клеток, может быть
заменена на среду Дюльбекко.
4.3.1. Замечания к процедуре А
1. Пробные тесты показали, что суспендирование клеток в щелочной среде
RPMI-1640 (или среде Дюльбекко) представляет собой решающий этап для
стадии слияния. По некоторым причинам слияние лучше происходит в щелочной
среде и при этом благодаря кратковременности инкубации клетки не
повреждаются. Распределение клеток по стенкам пробирки при ее вращении
тоже повышает эффективность слияния, по-видимому, потому, что это
гарантирует равномерное перемешивание и тесный контакт клеток. Не
возникает необходимости в использовании бани на 37 °С в ламинарном боксе,
но клетки следует держать при температуре около 37 °С.
2. Большинство авторов рекомендуют добавлять ПЭГ медленно. Пробные тесты
показали, что это не дает преимущества в случае методики А. Однако если,
поместив ПЭГ на дно пробирки, попытаться распределить его в среде так,
чтобы обеспечить контакт со всеми клетками, расположенными на стенках
пробирки, то смешивание ПЭГа со средой происходит очень медленно. Тем не
менее крайне важно, чтобы после слияния ПЭГ разбавляли медленно.
Несколько порций среды, добавленные приблизительно с интервалом в 1 мин,
создают условия, удовлетворяющие этому требованию. Быстрое же разбавление
ведет к осмотическому повреждению клеток.
3. Обычно после слияния раскапывают по одной капле ре-суспендированную
клеточную смесь в пустые лунки и оставляют панели в тепле. Мы обнаружили,
что целесообразно до внесения клеточной суспензии добавить в лунки по
одной капле холодной 50%-ной лошадиной сыворотки. Это, по-видимому,
подавляет рост "фоновых" клеток, в то же время не влияя на рост гибридом.
4.3.2. Замечания к процедуре Б
1. При осуществлении этой методики не использовалась щелочная среда RPMI-
1640 или Дюльбекко. Щелочные значения pH достигаются еще до стадии
слияния промыванием клеток в свободной от сыворотки среде RPMI-1640,
после чего клетки оставляют в очень небольшом объеме среды на 5 мин для
достижения температуры 37 °С. За это время среда защелачи-вается.
2. Крайне важно, чтобы после слияния разбавление ПЭГ происходило
медленно. Цвет клеточного осадка после центри-
134
Глава 3
фугирования, следующего за процедурой слияния, служат индикатором
осмотического повреждения клеток. Если осадок клеток значительно бледнее,
чем исходной смеси спленоцитов и клеток плазмацитомы, то произошел
некоторый лизис эритроцитов, а следовательно, и осмотическое повреждение
гибридных клеток. Если клеточный осадок выглядит беловатым, то
вероятность успешного слияния очень низка. В этом случае не имеет смысла
вносить клеточную суспензию в лунки.
5. Селекция гибридом
Селекция гибридом, образующих специфические антитела, обычно происходит в
два этапа. Сначала культуральную жидкость анализируют на содержание
антител, специфичных к данному иммуногену. Положительные супернатанты
затем подвергают скринингу с использованием тест-панели антигенов, чтобы
обнаружить, связываются ли выявленные антитела селективно с интересующим
исследователя антигеном. Лунки с нужными гибридомами неизменно составляют
только небольшой процент от общего числа лунок с растущими или
антителопродуцирующими клетками. Важно идентифицировать нужные
гибридомные клоны как можно скорее, в противном случае непроизводительно
расходуются время и материалы для размножения большого числа бесполезных
линий. Успех процедуры гибридизации для получения специфических антител в
большой степени зависит от тщательного выполнения скрининга. Необходимо
выявить данные антитела н отбросить ненужные клоны быстро и без сомнения.
Выбор используемой процедуры скрининга зависит от дальнейшего возможного
использования моноклональных антител. Другими словами, если вы намерены
получить моноклональные антитела, которые предполагаете использовать для
лизиса клеток в присутствии комплемента, то и для скрининга следует
использовать соответствующий тест (реакцию комплемент-за-висимого
лизиса). Подобно этому, если моноклональные антитела предполагается
использовать в реакциях преципитации или для окрашивания заключенных в
парафин препаратов тканей при иммуногистологических исследованиях, то
именно эти методы и должны использоваться для скрининга гибридом. Тест,
используемый для скрининга, в идеале должен удовлетворять следующим
критериям:
1. Быть настолько простым, чтобы его мог успешно и уверенно проводить
технический персонал лаборатории. Если используется простая тест-система,
то более информативно собрать аликвоты со всей культуральной панели и,
