Антитела. Методы. Книга 1 - Кэтти Д.
ISBN 5-03-002363-1
Скачать (прямая ссылка):
колонках со смесью других изотипов, содержащих как х-, так и Л-цепи.
Получение чистого IgG2a мыши для иммунизации и адсорбции может быть
осуществлено физико-химическими методами (разд. 10.6.1).
Иммунизация гомогенными миеломными белками и ин-тактными молекулами
моноклональных антител может привести к образованию как
изотипспецифических, так и анти-идиотипических антител. Этого можно
избежать, если использовать Fc-фрагменты. Можно и сорбировать сыворотку с
помощью .Fab-фрагментов иммуногена. Если антиидиотипичес-кие антитела не
являются помехой при дальнейшем использовании антисыворотки,
антиизотипическую ее специфичность можно определить, иРпользуя другие
МКА, которые отличаются по вариабельной области .(Fab-фрагменту) от МКА,
использованных при иммунизации.
V. Полиспецифическая антииммуноглобулиновая сыворотка. В ответ на
иммунизацию каким-то одним интактным иммуноглобулином образуются антитела
к легким цепям, которые связываются с иммуноглобулинами всех классов и
под-
Получение поликлональных антител н контроль нх качества
105
Таблица 2.6. Применение очищенных иммуноглобулинов и их субъединиц
Иммунногены - Fc-фрагменты IgG; IgM, IgA, IgE, IgD - очищенные ннтакт-ные
молекулы, х- и Л-цепн.
Иммуносорбенты - для удаления перекрестно реагирующих антиизотипических
антител, для аффинной очнсткн антнглобулннов.
Стандартные антигены - для проверки антнглобулннов н количественной
оценки иммуноглобулинов.
Фракция сыворотки для мечения антител.
Исходный материал для аффинной очистки антител.
Первый этап получения стандартных антител к белкам н антителам.
Антитела с низким фоном в иммунологических методах исследования.
классов, и, следовательно, такая антисыворотка будет анти-
иммуноглобулиновой. Однако, если для иммунизации не использовать смесь
очищенных интактных молекул, баланс антител будет сдвинут в сторону того
класса иммуноглобулинов, .который используют для иммунизации. Наилучшее
решение- смешать в подходящих пропорциях абсорбированные сыворотки,
полученные к каждому классу и подклассу, и ан-тисыворотки к х- и Я-цёпям.
10. Очистка иммуноглобулинов и субъединиц IgG
Очищенные иммуноглобулины необходимы для разных целей (см. табл. 2.6).
10.1. Очистка IgG человека
10.1.1. Простой метод
1. Приготовляют анионообменник ДЭАЭ-целлюлозу (Whatman DE52) в 0,01 М
фосфатном буфере, pH 7,2.
2. Диализуют сыворотку человека против 10 объемов буфера в течение 24 ч
при 4°С с 5-кратной сменой буфера.
3. Дают ионообменнику осесть в мензурке, а затем удаляют избыток буфера.
Переносят ДЭАЭ в небольшую мензурку или универсальный флакон и добавляют
сыворотку (4-5 мл " ДЭАЭ на 1 мл диализованной сыворотки). Тщательно
перемешивают и оставляют смесь при комнатной температуре на
1 ч, периодически перемешивая.
4. Переносят смесь ,в толстостенную центрифужную пробирку, центрифугируют
(4000 об/мин, 4 °С, 20 мин) и собирают супернатант - фракцию IgG. Можно
поступить иначе: перенести ДЭАЭ в шприц, перекрытый фильтровальной
бумагой, и вытеснить раствор IgG, нажимая на поршень. При этом ДЭАЭ
задерживает все сывороточные белки, кроме IgG. Некоторые авторы
рекомендуют применять 0,02 М фосфатный буфер и pH 8,0.
106
Глава 2
10.1.2. Многоступенчатый метод, повышающий степень очистки
1. К цельной сыворотке на льду при перемешивании по капле добавляют
насыщенный ('при 0°С) раствор сульфата аммония в количестве, необходимом
для получения 33%-ного (по объему) насыщенного раствора. Выдерживают 1 ч
на льду rfpH помешивании (избегают вспенивания!), центрифугируют (3000
об/мий, 15 мин), а затем отмывают преципитат ледяным насыщенным (33%)
раствором сульфата аммония в дистиллированной воде при центрифугировании
и ресуспендировании.
2. Вновь отмывают преципитат и удаляют супернатант. Растворяют пфеципитат
,(без вспенивания) в 0,01 М фосфатном буфере, pH 7,2 (объем буфера - '/з
от исходного объема сыворотки) и диализуют раствор эуглобулина против
того же буфера, как описано ,в разд. 10.1.1.
3. Готовят колонку с ДЭАЭ-целлюлозой, уравновешенную 0,01 М фосфатным
буфером из расчета 15-20 мл объема осадка на 5 мл раствора эуглобулина.
Хорошо отмывают колонку, и, когда ДЭАЭ-целлюлоза осядет, удаляют избыток
буфера, и наносят сверху эуглобулин. Когда последний проникнет в матрикс,
добавляют буфер и подключают резервуар с буфером.
4. Пропускают буфер через колонку со скоростью около 20 мл в час, отбирая
образцы по 5 мл. Определяют элюцию очищенного IgG с помощью УФ-монитора
или спектрофотометра при 280 нм. Концентрацию определяют, исходя нз того,
.что 1 мг/мл (1 см) = 1,45.
5. Определяют чистоту фракции методом ИЭФ, внося в лунки раствор,
содержащий 10 мг белка в 1 мл, и используя антисыворот'ки к ,белкам
сыворотки человека и IgG (Fqf). Применяют нормальную сыворотку человека
(исходный материал) и очищенный IgG в качестве стандартов.
6. Колонку можно отмыть PBS для удаления ,связавшихся белков и
уравновесить 0,01 М фосфатным буфером для повторного использования.
